Électrophorèse sur gel reste une technique fondamentale en biologie moléculaire, permettant aux chercheurs de séparer les fragments d'ADN par taille et par charge pour des applications telles que les empreintes génétiques, la cartographie de restriction et le séquençage.
L’ADN lui-même étant incolore, les scientifiques ajoutent des colorants de suivi (pigments bleus ou orange) à l’échantillon. Ces colorants migrent avec l'ADN, fournissant une référence visuelle qui permet à l'utilisateur d'évaluer les progrès et de garantir une identification précise de la bande.
Dans cette méthode, une plaque de gel d'agarose -un polysaccharide dérivé d'algues-est préparé en mélangeant de la poudre d'agarose avec un tampon contenant de l'eau et du sel. Le mélange est chauffé jusqu'à dissolution de l'agarose, puis refroidi pour former une matrice poreuse. Le gel est placé dans une chambre d'électrophorèse et recouvert d'un tampon conducteur.
Des échantillons d'ADN, combinés à un colorant de chargement, sont chargés dans des puits situés à l'extrémité négative (-) du gel. Une électrode positive (+) est positionnée du côté opposé. Le squelette phosphate chargé négativement de l'ADN conduit les fragments vers l'électrode positive lorsque le champ électrique est appliqué.
Les fragments plus petits rencontrent moins de résistance et se déplacent plus rapidement, produisant des bandes distinctes qui correspondent à la taille du fragment.
Les colorants de chargement remplissent deux fonctions principales :ils augmentent la densité de l’échantillon afin qu’il coule dans le puits, et ils fournissent un repère visuel qui suit la migration de l’ADN. Les colorants courants incluent le bleu de bromophénol. (optimal pour les fragments autour de 400 pb) et xylène cyanol (mieux adapté aux fragments de 2 à 8 kbp). Le colorant est choisi de manière à ne pas réagir avec l’ADN ni à l’altérer. Les chercheurs utilisent généralement 5 µL de colorant de charge pour 1 µL d'échantillon d'ADN, conformément aux directives de NEB et de Thermo Fisher.
Du glycérol est ajouté à l'échantillon pour augmenter sa densité. Sans glycérol, l'échantillon liquide se répandrait sur la surface du gel au lieu de se déposer proprement dans le puits, compromettant la formation de bandes claires et distinctes.
Pour la séparation des protéines, l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide (SDS‑PAGE) remplace l’agarose. Le bleu de bromophénol est régulièrement incorporé au tampon d’échantillon ; il se déplace au même rythme que le bord d'attaque des bandes protéiques, offrant un indicateur visuel en temps réel de la progression.
Après électrophorèse, des colorants liant l'ADN tels que le bromure d'éthidium sont appliquées. Le bromure d'éthidium s'intercale entre les bases de l'ADN et émet une forte fluorescence sous la lumière ultraviolette, rendant les bandes visibles. Parce qu'il est mutagène, des précautions de sécurité strictes sont nécessaires lors de la manipulation et de l'élimination du colorant.