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Aux débuts du génie génétique, l’idée de greffer des traits d’un organisme sur un autre semblait tirée par les cheveux. Aujourd’hui, cependant, l’insertion d’ADN étranger dans le génome d’un hôte est un processus de routine, qu’il s’agisse d’ajouter des gènes résistants aux ravageurs au maïs, d’exprimer l’insuline humaine dans des bactéries ou de modéliser des cancers humains chez la souris. Même si les détails techniques peuvent être complexes, la séquence globale des étapes reste cohérente et logique.
Commencez par traiter l’ADN plasmidique et le fragment d’ADN étranger avec une enzyme de restriction choisie. Ces enzymes reconnaissent des motifs de base spécifiques et effectuent des coupes précises, générant ainsi des extrémités compatibles pour la ligature en aval. Les enzymes de restriction sont naturellement dérivées des systèmes de défense bactériens qui clivent l'ADN viral envahisseur.
Ensuite, mélangez le squelette plasmidique digéré avec l’ADN étranger clivé et ajoutez l’ADN ligase. Les extrémités collantes complémentaires qui en résultent s'hybrident et la ligase scelle les entailles, produisant des plasmides circulaires qui portent le segment d'ADN inséré.
Introduire les plasmides recombinants dans les cellules bactériennes compétentes et leur permettre de récupérer. Les colonies ayant absorbé le plasmide se développeront sur des milieux sélectifs contenant l'antibiotique approprié, grâce au marqueur de résistance codé sur le plasmide. La transformation peut être obtenue par choc thermique, électroporation ou compétence chimique, selon la souche bactérienne.
Récoltez les cellules de colonies individuelles, lysez-les avec un tampon détergent pour libérer l’ADN plasmidique, puis dénaturez les brins par traitement thermique ou alcalin. Cela prépare l'ADN pour le criblage en aval.
Hybridez l’ADN extrait avec une sonde marquée par fluorescence complémentaire à la séquence insérée. Exposer l'échantillon à un éclairage UV ; les régions de correspondance parfaite émettront de la fluorescence, confirmant la présence du gène étranger.
Sélectionnez les colonies testées positives pour l’insert, développez-les et isolez l’ADN plasmidique. Amplifiez le plasmide, si nécessaire, par PCR pour générer suffisamment de matériel pour des analyses plus approfondies ou des applications en aval.