1. Obtention du gène humain d'intérêt
* Isolement de l'ADN humain: Le gène humain souhaité est extrait des cellules humaines en utilisant des techniques telles que la digestion enzymatique de restriction ou la PCR (réaction en chaîne par polymérase).
* Synthèse: Le gène peut également être synthétisé artificiellement, en utilisant la technologie de synthèse des gènes, qui est souvent plus efficace pour les gènes complexes.
2. Préparation du vecteur plasmidique
* Sélection du plasmide: Un vecteur plasmidique approprié est choisi, souvent un avec plusieurs sites de clonage (MC), des gènes de résistance aux antibiotiques et d'autres caractéristiques qui facilitent le clonage.
* Digestion des enzymes de restriction: Le plasmide est ouvert sur des sites spécifiques en utilisant des enzymes de restriction, créant des "extrémités collantes" qui sont compatibles avec le gène humain.
3. Ligature (jointure) du gène et du plasmide
* Compatibilité: Les extrémités collantes du gène humain et du plasmide linéarisé sont conçues pour être compatibles, ce qui leur permet de se lier ensemble par un appariement de base complémentaire.
* enzyme ligase: L'ADN ligase est utilisée pour catalyser la formation de liaisons de phosphodiester, rejoignant définitivement le gène humain dans le plasmide.
4. Transformation en bactéries
* cellules compétentes: Les cellules bactériennes sont rendues "compétentes" pour prendre l'ADN par diverses méthodes, telles que le choc thermique ou l'électroporation.
* Introduction: Les plasmides recombinants sont introduits dans les bactéries compétentes.
* Sélection: Les bactéries qui ont réussi à prendre le plasmide sont sélectionnées en les cultivant sur des supports contenant des antibiotiques. Seules les bactéries avec le plasmide se développeront en raison du gène de résistance aux antibiotiques.
5. Vérification et confirmation
* colonie PCR: La PCR est utilisée pour confirmer la présence du gène humain dans les colonies bactériennes.
* Séquençage: La séquence du gène inséré est vérifiée par séquençage d'ADN pour s'assurer qu'elle est correcte et intacte.
Composants et considérations clés:
* Enzymes de restriction: Ces enzymes coupent l'ADN à des séquences spécifiques, créant des extrémités compatibles pour la ligature.
* dNA ligase: Cette enzyme rejoint les extrémités des brins d'ADN ensemble.
* marqueurs de résistance aux antibiotiques: Ces gènes sur le plasmide permettent la sélection de bactéries qui ont réussi à incorporer le plasmide.
* MCS (plusieurs sites de clonage): Cette région du plasmide contient plusieurs sites d'enzyme de restriction, permettant l'insertion de différents gènes.
Pourquoi est-ce important?
* Production de protéines: Les bactéries recombinantes peuvent être utilisées pour produire de grandes quantités de protéines humaines, telles que l'insuline ou l'hormone de croissance, à des fins thérapeutiques.
* Outils de recherche: Les plasmides recombinants sont essentiels pour le clonage des gènes et les études d'expression génique.
* Thérapie génique: Dans certains cas, les plasmides recombinants contenant des gènes thérapeutiques peuvent être utilisés pour fournir des gènes correctifs aux cellules de la thérapie génique.
Remarque: Les détails spécifiques du processus peuvent varier en fonction du gène cloné, de l'hôte bactérien et de l'application souhaitée.
