Une équipe de chercheurs interdisciplinaires dirigée par Penn State a développé des techniques pour améliorer l'efficacité de CRISPR-Cas9, la technique d'édition du génome qui a valu le prix Nobel en 2020. Alors que CRISPR-Cas9 est plus rapide, moins cher et plus précis que les autres techniques d'édition de gènes méthodes, selon le chef de projet Xiaojun "Lance" Lian, professeur agrégé de génie biomédical et de biologie à Penn State, la technologie a des limites, en particulier dans les applications visant à améliorer la santé humaine.

Les chercheurs ont développé un processus plus efficace et accessible pour appliquer les systèmes CRISPR-Cas9 dans les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), dérivées de lignées de cellules souches approuvées par le gouvernement fédéral, qui, selon Lian, pourraient grandement faire progresser les diagnostics et les traitements des troubles génétiques. L'approche a été publiée le 7 septembre dans Cell Reports Methods .

CRISPR-Cas9, qui signifie répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées et protéine 9 associée à CRISPR, donne aux scientifiques la possibilité de cibler des emplacements précis du code génétique pour modifier l'ADN, offrant ainsi la possibilité de créer de nouveaux outils de diagnostic et de corriger potentiellement les mutations pour traiter les causes génétiques de la maladie.

"Le génome humain est énorme, et CRISPR-Cas9 permet aux scientifiques de trouver et de cibler un gène muté dans le but de l'étudier", a déclaré Lian.

CRISPR utilise un disque de matériel génétique, connu sous le nom d'ADN plasmidique, pour délivrer de l'acide ribonucléique (ARN) guidé qui positionne l'enzyme Cas9 à l'emplacement précis du gène cible. Lorsque l'ADN est localisé, Cas9 s'y lie et le coupe, permettant à un autre ADN de réparer la coupure. Les chercheurs peuvent alors voir comment la suppression modifie l'expression du gène. Mais il y a des problèmes d'efficacité de livraison et d'édition avec les méthodes CRISPR actuelles basées sur l'ADN, selon Lian.

"La livraison d'effecteurs ADN CRISPR est faible", a-t-il déclaré. "Seules 20 à 30 % des cellules ciblées recevront de l'ADN d'édition de gènes lors de l'utilisation de CRISPR. La livraison d'ARN dans les cellules peut être plus efficace ; cependant, lorsque de l'ARN régulier est introduit, les cellules peuvent le voir comme un virus. Ils détruisent le L'ARN avant qu'il ne puisse fabriquer des protéines - disons, en quelques heures - et, ce faisant, détruire la tentative d'édition de gènes."

Pour améliorer les résultats, les chercheurs ont changé la façon dont les outils d'édition du génome sont livrés aux cellules souches, en utilisant de l'ARN modifié (modARN). Le modRNA diffère de l'ADN plasmidique en ce qu'il remplace l'un des substrats de base trouvés dans l'ARN par une version chimiquement modifiée, et il est stabilisé par un support structurel plus fort.

"Le modRNA s'est avéré nettement plus efficace que l'ADN plasmidique", a déclaré Lian. "Environ 90 % des cellules ont reçu le modRNA d'une simple transfection, il a donc pu rester en place et faire son travail."

Les chercheurs ont également découvert que la durée pendant laquelle le modARN était en place était idéale :suffisamment longue pour modifier les cellules, mais pas trop longtemps pour provoquer une activité hors cible. Mais le modRNA a introduit un autre problème, selon Lian.

Lorsque le modRNA Cas9 est délivré avec succès au gène cible, il crée une cassure double brin dans le génome, que certaines cellules essaieront de réparer. Ceux qui se réparent peuvent transmettre la réparation, ou « mutation », à leur progéniture. C'est le processus que les chercheurs veulent mieux comprendre, donc ce sont les cellules qu'ils veulent récolter et étudier. Le problème, a déclaré Lian, est que la plupart des cellules présentant cette rupture l'identifient comme un problème majeur avec le génome et s'autodétruiront au lieu d'essayer de se réparer.

Pour réduire les effets secondaires toxiques de Cas9 et aider les cellules modifiées à survivre, l'équipe de Lian a introduit une petite protéine connue pour aider les cellules à se développer. Selon Lian, cette protéine ajoutée a inhibé la mort cellulaire et amélioré l'efficacité de l'édition de Cas9 jusqu'à 84 %.

Les chercheurs ont également découvert que le modRNA pouvait améliorer d'autres techniques d'édition de gènes, telles que l'édition de base. L'édition de base peut éliminer des gènes ou corriger des mutations dans le génome en utilisant une protéine pour modifier un seul nucléotide au lieu de couper les deux brins, comme le fait CRISPR.

"Nous avons transfecté des cellules souches avec une protéine d'édition de base à base de plasmide ou de modARN", a déclaré Lian. "Notre méthode basée sur le modRNA était plus de quatre fois plus efficace, à 68 %, que la technique basée sur le plasmide, à environ 16 %, pour éditer le génome avec succès."

Selon Lian, à mesure que de plus en plus de laboratoires d'édition de gènes améliorent l'efficience et l'efficacité de l'édition de gènes, les chercheurs pourront mieux comprendre les gènes et leurs fonctions plus rapidement.

"Le corps humain compte plus de 20 000 gènes, mais nous n'étudions les fonctions que d'environ 10% d'entre eux", a déclaré Lian. "Examiner le but de chaque gène restant, un à la fois, pourrait prendre toute une vie. L'utilisation de cellules souches modifiées à partir de nos techniques d'édition de gènes hautement efficaces peut considérablement accélérer ce processus." + Explorer plus loin

Étudier les maladies avec une meilleure fourniture d'outils d'édition de gènes