Ce protocole décrit une méthode courante pour mesurer l'activité de nitrate réductase en utilisant du nitrite de sodium comme standard.
Matériaux:
* Matériau végétal: Feuilles fraîches, racines ou autres tissus contenant du nitrate réductase.
* Tampon d'extraction:
* Tampon Tris-HCl de 100 mm, pH 7,5
* 1 mm EDTA
* 10 mm dtt (dithiothreitol)
* 0,1% (p / v) albumine sérique bovine (BSA)
* Mélange réactionnel:
* Tampon de phosphate de potassium 100 mm, pH 7,5
* 10 mm de nitrate de sodium
* 1 mm nadh
* Solution standard en nitrite de sodium: Préparez une solution standard de concentration connue (par exemple, 100 ppm).
* réactif GRIESS: (reportez-vous à des instructions de protocole spécifiques)
* spectrophotomètre: Pour mesurer l'absorbance à 540 nm.
* centrifugeuse: Pour séparer les débris cellulaires.
* Bath glace: Pour maintenir les températures froides.
* pipettes et conseils: Pour les mesures de volume précises.
Procédure:
1. Préparation des échantillons:
* Récolter le matériel végétal et rincer rapidement à l'eau distillée froide.
* Pesez une quantité appropriée de tissu (par exemple, 0,1-1 g) et le broyer dans un mortier et un pilon avec de l'azote liquide ou en utilisant un homogénéisateur dans un tampon d'extraction.
* Centrifuger l'homogénat à 10 000 g pendant 10 minutes à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est votre extrait enzymatique.
2. test de nitrate réductase:
* Préparez une série de tubes contenant le mélange réactionnel, y compris des blancs sans extrait enzymatique et des tubes avec des concentrations variables de nitrite de sodium.
* Ajoutez un volume approprié d'extrait d'enzyme dans les tubes de réaction.
* Commencez la réaction en ajoutant NADH.
* Incuber les tubes à 30 ° C pendant une heure spécifique (par exemple, 30 minutes).
* Terminez la réaction en ajoutant un réactif Griess.
3. Mesure de la production de nitrite:
* Incuber les tubes dans l'obscurité pendant au moins 15 minutes pour permettre le développement des couleurs.
* Mesurez l'absorbance à 540 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
* Préparez une courbe standard en utilisant les concentrations connues de nitrite de sodium.
* Calculez la quantité de nitrite produite par l'extrait d'enzyme en utilisant la courbe standard.
4. Calcul de l'activité nitrate réductase:
* Exprimer l'activité de nitrate réductase comme µmoles de nitrite produit par minute par gramme de poids frais (FW) ou de protéine .
Remarque:
* Ce protocole est un contour de base et des modifications spécifiques peuvent être nécessaires en fonction des espèces végétales et de la configuration expérimentale.
* Assurez-vous que toutes les solutions sont préparées et stockées de manière appropriée.
* Utilisez des réactifs de haute qualité pour des résultats précis.
* Contrôle de l'absorbance de fond en mesurant l'absorbance des blancs sans extrait enzymatique.
* Répétez le test au moins trois fois pour assurer la reproductibilité.
réactif Griess:
* Le réactif Griess est utilisé pour détecter le nitrite en réagissant avec lui pour produire un colorant azo de couleur violet.
* Différents réactifs Griess peuvent être utilisés, alors reportez-vous au protocole spécifique pour la préparation et l'utilisation.
Méthodes alternatives:
* D'autres méthodes de mesure de l'activité de nitrate réductase incluent l'utilisation de nitrate comme substrat et détecter la réduction du nitrate en nitrite.
* Mesure spectrophotométrique Peut être utilisé pour mesurer directement le changement de la concentration de NADH au fil du temps.
Interprétation:
L'activité de nitrate réductase est un indicateur de la capacité de la plante à réduire le nitrate en nitrite, ce qui est une étape cruciale dans l'assimilation de l'azote. La comparaison de l'activité dans différents tissus ou dans différentes conditions peut révéler des informations précieuses sur le métabolisme de l'azote de la plante.
Informations supplémentaires:
* Modifications du protocole pour des espèces ou conditions de plantes spécifiques: Reportez-vous à la littérature scientifique pertinente ou aux experts en contact pour obtenir des conseils.
* Dépannage: Consultez les guides de dépannage ou consultez des experts si vous rencontrez des problèmes avec le test.
Ce protocole fournit un cadre général pour mesurer l'activité de nitrate réductase en utilisant du nitrite de sodium comme standard. Adaptez-le à vos besoins spécifiques et assurez-vous des résultats précis.
