L'enzyme nitrogénase est un catalyseur biologique qui peut réduire le diazote (N2) en ammoniac en présence d'une suite de métallocofacteurs complexes. Cependant, les détails mécanistiques de la réaction restent rares. Dans un nouveau rapport sur Science , Wonchull Kang et une équipe de recherche en chimie, biologie moléculaire et biochimie à l'Université de Californie-Irvine, NOUS., ont rapporté une structure cristalline de 1,83 angström pour la protéine nitrogénase molybdène-fer (MoFe), qu'ils ont capturés dans des conditions physiologiques de renouvellement du diazote. Les résultats de l'étude peuvent évaluer les mécanismes possibles de N 2 réduction et le rôle des sites ceinture-soufre au cours du processus.

La nitrogénase est le catalyseur d'une étape critique du cycle mondial de l'azote, lors de la réduction ambiante du diazote atmosphérique (N 2 ) à l'ammoniac biodisponible (NH 3 ). L'enzyme molybdène nitrogénase contient deux composants protéiques :l'un contenant la protéine de fer (Fe) dans un soufre de fer (Fe 4 S 4 ) cluster avec un site de liaison à l'adénosine triphosphate (ATP) dans chaque sous-unité. L'autre, protéine de fer molybdène (MoFe) contenant un 2 ?? 2 hétérotétramère avec deux métalloclusters complexes. Au cours de la catalyse molybdène-nitrogénase (Mo-nitrogénase), l'association et la dissociation répétées entre les deux composants protéiques ont permis un transfert d'électrons dépendant de l'ATP à partir du Fe 4 S 4 cluster à la protéine MoFe pour la réduction du substrat. La capacité de la nitrogénase à transporter de nombreux électrons vers son cofacteur a rendu l'enzyme très polyvalente lors de la réduction du substrat.

Comprendre le mécanisme d'action de l'enzyme nitrogénase

De nombreux efforts ont été déployés pour comprendre les mécanismes de la nitrogénase depuis sa découverte, où certains s'étaient concentrés sur les interactions substrats et inhibiteurs de l'enzyme. De ces efforts, Kang et al. a déterminé une stratégie digne de considération en limitant les réserves d'électrons excédentaires qui ont conduit par inadvertance le N 2 processus de réduction en avant. Cela a ramené le substrat ou l'état de liaison intermédiaire de l'enzyme à un état de repos ou a réduit l'enzyme à un état mixte indiscernable. Le processus était pertinent car les protéines de la nitrogénase sont systématiquement isolées en présence d'un excès de dithionite en tant que réducteur fourni de l'extérieur, et l'élimination de cette source artificielle d'électrons en l'absence d'oxygène pourrait aider les scientifiques à capturer le diazote (N 2 ) ou ses intermédiaires pour l'analyse.

Comme preuve de concept, Kang et al. ont préparé l'extrait brut d'une souche bactérienne anaérobie Azotobacter vinelandii avec ou sans addition de dithionite après rupture cellulaire. La souche A. vinelandii a exprimé activement une Mo-nitrogénase contenant une protéine MoFe marquée à l'histidine dans les deux cas. Lorsqu'ils ont analysé l'activité de ces échantillons, les échantillons d'extraits bruts sans dithionite étaient presque inactifs pendant la réduction du substrat, en raison de l'épuisement des électrons dans les extraits bruts lors de la rupture des cellules. Kang et al. pourrait donc restaurer complètement l'activité des échantillons en ajoutant du dithionite et de l'ATP (c'est-à-dire en fournissant des électrons).

Amas de nitrogénase — deux métalloclusters uniques :le P-cluster et le M-cluster.

Sur la base des conditions décrites, lorsqu'une culture exprimant la nitrogénase qui effectue activement N 2 la fixation est soumise à une lyse cellulaire sans apports supplémentaires d'électrons, la nitrogénase est restée fonctionnelle. Bien que potentiellement arrêté dans un état "dormant" ou intermédiaire en raison du retrait du flux d'électrons dans un métallocluster fer-soufre connu sous le nom de M-cluster, situé dans l'enzyme nitrogénase. Lorsque Kang et al. purifié l'extrait brut sans dithionite, la protéine MoFe marquée à l'histidine (appelée AV1* dans l'étude) était active pendant N 2 réduction et également entièrement fonctionnel. Lorsque l'équipe a cristallisé AV1*, ils ont observé des cristaux bruns diffractés à une résolution de 1,83 angström (Å). Ils ont confirmé le réarrangement structurel des deux clusters P de AV1* en utilisant des données de densité anormale et ont utilisé la résonance paramagnétique électronique pour observer l'affectation structurelle. Les résultats leur ont fourni des réponses longtemps recherchées à la pertinence physiologique de cet état expérimental et ont indiqué un flux limité d'électrons entre les deux métalloclusters uniques (clusters P et M) du composé en l'absence de dithionite.

Un mécanisme d'action plausible en accord avec les observations expérimentales comprenait la réduction progressive du diazote (N 2 ) sur les trois sites de soufre de la ceinture sur le catalyseur de nitrogénase sur la base de la rotation du groupe M. Le mécanisme proposé commence par une liaison étroite de N 2 sur un site précis, suivi d'une rotation de la borne N 2 vers un autre site ultérieur (sites désignés comme S3A à S2B à S5A sur le composé). Pendant le processus, la réduction/protonation de N 2 au niveau de diazène s'est produit par liaison hydrogène, suivi d'une nouvelle réduction/protonation pour sa conversion en ammoniac, avant sa sortie de la structure. La rotation ultérieure du cluster a apporté un nouveau N 2 molécule au site suivant pour initier le prochain cycle de N par étapes 2 réduction par rotation continue des grappes dans un mécanisme délicat pendant la catalyse. Un tel cycle entre les différents sites de réaction était vaguement analogue au mécanisme de l'enzyme ATP synthase. Le métallocluster en rotation a donc effectivement permis la réduction multiélectronique de N 2 par une approche diviser pour régner.

To understand the sulfur-displaced conformation of AV1* under limited electron flux, the team formed AV1* turnover with dithionite (designated as AV1*TOD), to yield brown crystals that diffracted to a resolution of 1.73 Å. The observations were consistent with the mechanism of bound dinitrogen species on the compound and illustrated the physiological relevance of the conformation during catalysis. The capacity to displace three different sites by a dinitrogen species was consistent with previous investigations on catalysis-dependent selenium. Kang et al. proposed many mechanisms to explain the observations, however they seek further experimental support to verify them. The team highlighted the possibility for all belt-sulfur sites to be involved in the process of catalysis due to the presence of asymmetric belt-sulfur displacements in the compound. The results aim to provoke a paradigm shift in the mechanistic thinking of nitrogenase activity, ultimately to understand the intricate mechanism of the enzyme.

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