L'un des principaux défis de la production de biocarburants de deuxième génération est d'identifier les enzymes produites par des micro-organismes à utiliser dans un cocktail d'enzymes pour catalyser l'hydrolyse de la biomasse dans lequel les enzymes agissent ensemble pour décomposer les glucides dans les déchets de canne à sucre et la bagasse, par exemple, et les convertir en sucres simples pour la fermentation.

Un groupe de chercheurs de l'Université de Campinas (UNICAMP), travaillant en partenariat avec des collègues du Laboratoire national brésilien des biorenouvelables (LNBR) à Campinas, État de São Paulo, Brésil, ont découvert que Trichoderma harzianum , un champignon trouvé en Amazonie, produit une enzyme susceptible de jouer un rôle clé dans les cocktails enzymatiques.

L'enzyme, qui est appelée β-glucosidase et appartient à la famille des glycosides hydrolases 1 (GH1), agit dans la dernière étape de la dégradation de la biomasse pour produire du glucose libre pour la fermentation et la conversion en éthanol. Dans le laboratoire, cependant, les chercheurs ont observé que des niveaux élevés de glucose inhibaient l'activité de la -glucosidase.

"Nous avons également constaté que l'activité catalytique optimale de l'enzyme se produisait à 40 ° C. Cela représentait un autre obstacle à l'utilisation de l'enzyme car dans un environnement industriel, l'hydrolyse enzymatique de la biomasse est réalisée à des températures plus élevées, typiquement autour de 50 °C, " a déclaré Clelton Aparecido dos Santos, chercheur postdoctoral au Centre de biologie moléculaire et de génie génétique de l'UNICAMP (CBMEG) avec une bourse de la FAPESP.

Basé sur une analyse de la structure de l'enzyme combinée à des techniques de génomique et de biologie moléculaire, les chercheurs ont pu modifier la structure pour résoudre ces problèmes et améliorer considérablement son efficacité de dégradation de la biomasse.

L'étude résulte d'un projet avec une subvention de recherche régulière de la FAPESP et d'un projet thématique également soutenu par la FAPESP. Les résultats sont publiés dans la revue Rapports scientifiques .

"La protéine modifiée que nous avons développée s'est avérée bien plus efficace que l'enzyme non modifiée et peut être utilisée pour compléter les cocktails d'enzymes vendus aujourd'hui pour décomposer la biomasse et produire des biocarburants de deuxième génération, " a dit Santos.

Pour arriver à la protéine modifiée, les chercheurs ont d'abord comparé la structure cristalline de la molécule d'origine avec les structures d'autres β-glucosidases de type sauvage des familles de glycoside hydrolase GH1 et GH3. Les résultats de l'analyse ont montré que les glucosidases GH1 tolérantes au glucose avaient un canal de substrat plus profond et plus étroit que les autres -glucosidases et que ce canal limitait l'accès du glucose au site actif de l'enzyme.

Les -glucosidases moins tolérantes au glucose avaient un canal d'entrée du site actif moins profond mais plus large, permettant à une plus grande partie du glucose produit par ces enzymes d'entrer dans la dernière étape de la dégradation de la biomasse. Le glucose retenu bloque le canal de la protéine et réduit son activité catalytique.

Sur la base de ce constat, les chercheurs ont utilisé une technique de biologie moléculaire connue sous le nom de mutagenèse dirigée pour remplacer deux acides aminés qui pourraient agir comme des "gardiens" à l'entrée du site actif de l'enzyme, laisser entrer le glucose ou le bloquer. L'analyse de leurs expériences a montré que la modification rétrécissait le canal au site actif.

"Le site actif de l'enzyme mutante s'est rétréci à une taille similaire à celle des -glucosidases GH1 tolérantes au glucose, ", a déclaré Santos.

Efficacité accrue

Les chercheurs ont mené un certain nombre d'expériences pour mesurer les performances de la protéine améliorée dans la décomposition de la biomasse, surtout la bagasse de canne à sucre, un déchet agro-industriel au vaste potentiel d'utilisation rentable au Brésil. Lors d'un stage de recherche à l'étranger avec une bourse de la Fondation pour la recherche de São Paulo—FAPESP, Santos a travaillé avec un groupe de recherche dirigé par Paul Dupree, professeur à l'Université de Cambridge au Royaume-Uni, sur une analyse de l'efficacité de libération de glucose de l'enzyme adaptée lorsque différentes sources de biomasse végétale ont été converties.

L'analyse a montré que l'efficacité catalytique de l'enzyme modifiée était de 300 % supérieure à celle de l'enzyme de type sauvage en termes de libération de glucose. De plus, il était plus tolérant au glucose, donc plus de glucose a été libéré de toutes les matières premières de biomasse végétale testées. La mutation a également amélioré la stabilité thermique de l'enzyme pendant la fermentation.

"La mutation des deux acides aminés sur le site actif a rendu l'enzyme super efficace. Elle est prête pour une application industrielle, " a déclaré Anete Pereira de Souza, professeur à l'UNICAMP et chercheur principal du projet. "L'un des avantages de l'enzyme est qu'elle est produite in vitro et non à partir d'un champignon modifié ou d'un autre organisme, il peut donc être produit en série à un coût relativement bas."