Ce protocole décrit une méthode de base pour extraire l'ADN génomique des feuilles d'arachide en utilisant une approche simple et rentable.
Matériaux:
* Feuilles d'arachide (frais ou congelés)
* Azote liquide
* Mortier et pilon
* 1,5 ml de tubes de microcentrifugeuse
* 100 mm Tris-HCl (pH 8,0)
* 25 mm EDTA (pH 8,0)
* 1,4 m NaCl
* 10% SDS (dodécyl sulfate de sodium)
* Chloroforme:alcool isoamylique (24:1)
* Isopropanol
* À 70% d'éthanol
* RNase A Solution (10 mg / ml)
* Spectrophotomètre
Procédure:
1. Préparation des échantillons:
* Collectez des feuilles d'arachide fraîches ou congelées. Si vous utilisez des feuilles congelées, décongelez-les à température ambiante.
* Passer environ 0,1 à 0,2 g de tissu foliaire.
* Placer les feuilles dans un mortier préfabriqué et les broyer à une poudre fine à l'aide d'azote liquide.
2. lyse:
* Transférer les feuilles en poudre dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml.
* Ajouter 500 µl de tampon de lyse (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 25 mM, pH 8,0, NaCl 1,4 M et SDS à 10%).
* Incuber le tube à 65 ° C pendant 30 minutes avec des tremblements doux occasionnels. Cette étape décompose les parois et les membranes cellulaires, libérant l'ADN.
3. Élimination des protéines:
* Ajouter 200 µl de chloroforme:alcool isoamylique (24:1) au tube.
* Secouez vigoureusement le tube pendant 10 minutes.
* Centrifuger le tube à 10 000 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Cette étape sépare la solution en trois couches:couche aqueuse (haut), interphase (milieu) et couche organique (en bas). L'ADN est dans la couche aqueuse.
4. Précipitation d'ADN:
* Transférer soigneusement la couche aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml.
* Ajouter 0,5 volume d'isopropanol au tube et mélanger doucement. Cela précipitera l'ADN hors de la solution.
* Incuber le tube à -20 ° C pendant 30 minutes.
* Centrifuger le tube à 10 000 x g pendant 10 minutes à 4 ° C. Le culot d'ADN se formera au bas du tube.
5. lavage et séchage:
* Retirez le surnageant et lavez le culot d'ADN avec 500 µl d'éthanol à 70%.
* Centrifuger le tube à 10 000 x g pendant 5 minutes à 4 ° C.
* Retirez l'éthanol et séchez à l'air le culot pendant 5 à 10 minutes.
6. Respension et traitement de la RNase:
* Remettre en suspension le culot d'ADN dans 50 µl de tampon TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0).
* Ajouter 1 µl de solution RNase A (10 mg / ml) au tube.
* Incuber le tube à 37 ° C pendant 30 minutes pour éliminer tout ARN restant.
7. Quantification de l'ADN et vérification de la qualité:
* Quantifier l'ADN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm et 280 nm de longueurs d'onde. Le rapport de l'absorbance à 260 nm / 280 nm devrait être comprise entre 1,8 et 2,0, indiquant l'ADN pur.
Remarques:
* Ce protocole est une directive de base et peut avoir besoin d'être adapté en fonction du matériau foliaire spécifique et de la qualité souhaitée de l'ADN.
* Portez toujours des gants et des blouses de laboratoire lors de la manipulation des échantillons biologiques.
* Assurez-vous que tous les réactifs et équipements sont stériles pour éviter la contamination.
* Vous pouvez également utiliser des kits d'extraction d'ADN commerciaux pour un processus plus rationalisé et efficace.
Applications supplémentaires:
* L'ADN génomique isolé peut être utilisé pour diverses applications de biologie moléculaire, notamment:
* PCR (réaction en chaîne par polymérase)
* Séquençage d'ADN
* Analyse génétique
* Clonage
Ce protocole fournit une méthode simple et rentable pour isoler l'ADN génomique des feuilles d'arachide, ouvrant la voie à diverses recherches et applications.
