1. Lyse cellulaire:
* brisant les cellules: Il s'agit de la première étape, où la membrane cellulaire et la membrane nucléaire sont perturbées pour libérer l'ADN.
* Méthodes mécaniques: Il s'agit notamment de l'utilisation d'un mélangeur (pour des échantillons plus grands), de la sonication (utilisant des ondes sonores) ou du broyage des cellules (pour les tissus).
* Méthodes chimiques: L'utilisation de détergents (comme SDS) ou d'enzymes (comme le lysozyme) pour briser les membranes cellulaires.
2. Isolement de l'ADN:
* séparant l'ADN des autres composants cellulaires: Après lyse, le mélange contient de l'ADN, des protéines, des lipides et d'autres débris cellulaires.
* Digestion enzymatique: Des enzymes comme la protéinase K sont utilisées pour décomposer les protéines, séparant davantage l'ADN des autres composants cellulaires.
* Précipitation de sel: L'ajout de solutions de sel comme le chlorure de sodium peut provoquer le précipité de l'ADN hors de la solution, tandis que d'autres composants cellulaires restent dissous.
* Extraction organique: En utilisant des solvants organiques comme le phénol-chloroforme pour séparer l'ADN des protéines et d'autres composants cellulaires. L'ADN reste dans la phase aqueuse, tandis que les autres composants sont extraits dans la phase organique.
3. Purification de l'ADN:
* Suppression des contaminants: Après l'isolement, l'ADN peut toujours contenir des impuretés comme l'ARN ou les protéines.
* Précipitation à l'éthanol: L'ajout d'éthanol à la solution provoque un précipité sur l'ADN, permettant une purification supplémentaire.
* chromatographie sur la colonne: En utilisant des colonnes spécialisées avec des résines spécifiques qui se lient à l'ADN, permettant l'élimination sélective des contaminants.
4. Stockage d'ADN:
* Stockage de l'ADN purifié: L'ADN isolé peut être stocké dans des tampons à des températures spécifiques pour une utilisation à long terme.
Considérations supplémentaires:
* Type de cellule: La méthode utilisée dépendra du type de cellule étudiée, par exemple, les cellules bactériennes sont plus faciles à lyser que les cellules de mammifères.
* Quantité d'ADN nécessaire: La quantité d'ADN nécessaire affectera la méthode choisie.
* Applications en aval: L'utilisation prévue de l'ADN (par exemple, le séquençage, la PCR, le clonage) peut nécessiter des étapes de purification spécifiques.
Exemple:
Une méthode courante pour extraire l'ADN du sang implique:
1. lyse: Le sang est mélangé à un tampon de lyse contenant des détergents et des enzymes pour ouvrir les cellules et libérer l'ADN.
2. Élimination des protéines: La protéinase K est ajoutée pour digérer les protéines et séparer davantage l'ADN.
3. Centrifugation: Le mélange est tourné dans une centrifugeuse pour séparer l'ADN des autres composants cellulaires.
4. Précipitation d'éthanol: L'éthanol est ajouté pour précipiter l'ADN, qui est ensuite collecté par centrifugation.
5. Lavage et stockage: Le culot d'ADN est lavé pour éliminer les contaminants restants et stockés dans une solution tampon.
Cet aperçu simplifié met en évidence les étapes clés impliquées dans l'extraction d'ADN. Il existe des variations et des optimisations de ces méthodes en fonction des exigences expérimentales spécifiques.
