Méthodes pour isoler les acides aminés libres des protéines
1. Hydrolyse:
* Hydrolyse acide: La méthode la plus courante. Des acides forts (comme HCl) sont utilisés pour briser les liaisons peptidiques dans la protéine, libérant les acides aminés individuels.
* Procédure:
* L'échantillon de protéines est traité avec du HCl concentré (généralement 6 m) à des températures élevées (100-110 ° C) pendant 12-24 heures.
* Ce processus clive toutes les liaisons peptidiques, libérant des acides aminés libres.
* Après l'hydrolyse, l'acide est éliminé par évaporation, laissant le mélange d'acides aminés.
* Avantages: Efficace, relativement simple.
* Inconvénients: Peut entraîner une dégradation des acides aminés, en particulier le tryptophane. Certains acides aminés comme la cystéine peuvent être détruits ou modifiés.
* Hydrolyse enzymatique: Utilise des enzymes spécifiques (comme les protéases) pour décomposer les protéines en peptides et finalement des acides aminés libres.
* Procédure:
* Les enzymes spécifiques sont sélectionnées en fonction de la structure de la protéine et du résultat souhaité.
* L'incubation avec l'enzyme dans des conditions optimales permet une dégradation contrôlée.
* Avantages: Des conditions plus douces, moins de dégradation, peuvent être plus sélectives.
* Inconvénients: Peut être plus cher, plus lent que l'hydrolyse acide.
2. Séparation et purification:
* chromatographie:
* chromatographie d'échange d'ions: Sépare les acides aminés en fonction de leur charge.
* Chromatographie sur la taille-exclusion: Sépare les acides aminés en fonction de leur taille.
* Chromatographie liquide haute performance (HPLC): Méthode hautement sensible et précise pour séparer et quantifier les acides aminés.
* électrophorèse: Sépare les acides aminés en fonction de leur charge et de leur taille.
Considérations:
* Source des protéines: Le type de protéine avec lequel vous commencez influencera la meilleure méthode.
* Résultat souhaité: Cherchez-vous simplement à identifier la présence d'acides aminés gratuits, ou avez-vous besoin de les quantifier?
* Sensibilité: Le niveau de sensibilité requis dans l'analyse.
* Coût et équipement: Considérez les ressources disponibles.
flux de travail général:
1. Préparation des protéines: Isoler et purifier la protéine d'intérêt.
2. Hydrolyse: Choisissez la méthode d'hydrolyse appropriée (acide ou enzymatique).
3. Séparation et purification: Sélectionnez et optimisez la méthode de séparation et d'isolement des acides aminés libres.
4. Identification et quantification: Utilisez des techniques telles que la chromatographie, l'électrophorèse ou d'autres méthodes analytiques pour identifier et quantifier les acides aminés libres.
Remarque importante: Les procédures et conditions spécifiques pour isoler les acides aminés libres des protéines varieront en fonction de la source de protéines, du résultat souhaité et des ressources disponibles.
