Par Andy Pasquesi
Mis à jour le 30 août 2022
Les enzymes accélèrent les réactions chimiques en réduisant l'énergie d'activation requise pour la conversion du substrat. Le chiffre d'affaires, kcat , quantifie l'efficacité catalytique d'une enzyme en mesurant le nombre de molécules de substrat converties en produit par site actif d'enzyme et par seconde dans des conditions de saturation du substrat.
Tracez la concentration du produit en fonction du temps pour le premier tube à essai de votre test enzymatique. Utilisez le temps sur l'axe horizontal et la concentration du produit sur l'axe vertical.
Calculer la pente de la partie linéaire de la courbe (vitesse initiale, V0 ). Dans Excel ou une calculatrice graphique, la droite de régression linéaire vous donnera directement la pente. Si vous préférez une estimation manuelle, divisez la variation de la concentration du produit entre deux points de données consécutifs par la variation temporelle correspondante.
Enregistrez cette pente comme vitesse de réaction initiale, V0 , pour ce tube à essai. Dans l'équation de régression [Product] = m·time + b , le coefficient m est V0 .
Répétez les étapes 1 à 3 pour chaque tube à essai du test afin d'obtenir une série de V0. valeurs à différentes concentrations de substrat.
Créez un tracé Lineweaver–Burk (double réciproque) :tracé 1/[S] (concentration inverse du substrat) sur l'axe horizontal et 1/V0 (vitesse initiale inverse) sur l’axe vertical. Par exemple, si un tube à essai a une concentration initiale de substrat de 50 µM et un V0 de 80 µMs
–1
, le point tracé serait (1/50 µM, 1/80 µMs
–1
).
Effectuez une régression linéaire sur ces points. L'équation résultante prend la forme 1/V0 = m·(1/[S]) + b , où b est l'ordonnée à l'origine.
Calculer l'inverse de Vmax en prenant l'inverse de l'ordonnée à l'origine :1/Vmax = 1/b .
Inversez la valeur de l'étape 3 pour obtenir Vmax. :
Vmax = 1/(1/Vmax) = b
Identifiez la concentration en enzyme utilisée dans le test (cette valeur est constante dans tous les tubes à essai et doit être signalée dans les données brutes).
Calculer kcat en divisant Vmax par la concentration en enzyme :
kcat = Vmax / [E]
Cela donne le nombre de molécules de substrat converties par site actif enzymatique et par seconde.
En suivant ces étapes systématiques :mesurer les vitesses initiales, construire un tracé Lineweaver-Burk, extraire Vmax , et en normalisant la concentration en enzyme :vous pouvez déterminer avec précision le nombre de renouvellement d'une enzyme, kcat , une mesure fondamentale en enzymologie et en développement de médicaments.