1. Traduction de Nick:
* réaction: Cette méthode utilise l'enzyme ADN polymérase I pour remplacer les nucléotides dans un brin d'ADN par des nucléotides marqués. Il fonctionne en introduisant des pauses à brin (Nicks) dans l'ADN en utilisant dnase i . La polymérase utilise ensuite le Nick comme amorce et intègre des nucléotides marqués dans l'espace.
* isotopes: Les isotopes couramment utilisés sont ³²p-dctp ou ³²p-datp .
* Avantages: Produit une activité spécifique élevée (densité d'étiquette) et convient à l'ADN à un et double brin.
* Inconvénients: Nécessite une enzyme spécifique et peut être sensible aux conditions de tampon.
2. Étiquetage aléatoire d'amorce:
* réaction: Cette méthode utilise de courtes amorces d'oligonucléotides aléatoires et ADN polymérase I (Fragment klenow) pour synthétiser un nouveau brin d'ADN complémentaire au brin de modèle. La polymérase intègre des nucléotides marqués pendant la synthèse.
* isotopes: Les isotopes couramment utilisés sont ³²p-dctp ou ³²p-datp .
* Avantages: Efficace et peut être utilisé pour étiqueter l'ADN à un brin simple et double.
* Inconvénients: Peut introduire un étiquetage d'arrière-plan en raison de la liaison aléatoire de l'amorce.
3. Étiquetage final avec kinases:
* réaction: Cette méthode utilise la polynucléotide kinase Pour ajouter un groupe de phosphate à l'extrémité 5 'd'un fragment d'ADN. Le groupe phosphate est marqué avec un isotope radioactif.
* isotopes: Typiquement ³²p-atp ou ³³p-atp sont utilisés.
* Avantages: Simple et simple, particulièrement utile pour étiqueter les fragments d'ADN courts.
* Inconvénients: Étiquette uniquement l'extrémité 5 'de l'ADN.
4. Étiquetage de PCR:
* réaction: Cette méthode consiste à utiliser DNTPS radioactif (comme ³²p-dctp ) pendant la réaction de PCR. Cela intègre l'étiquette dans les brins d'ADN nouvellement synthétisés.
* isotopes: Les isotopes couramment utilisés sont ³²p-dctp ou ³²p-datp .
* Avantages: Efficace et peut être utilisé pour étiqueter des séquences d'ADN spécifiques.
* Inconvénients: Peut être moins efficace que les autres méthodes et peut être difficile pour obtenir une activité spécifique élevée.
5. Transcription in vitro:
* réaction: Utilise ARN polymérase Pour transcrire une matrice d'ADN dans l'ARN. L'ARN est marqué avec des nucléotides radioactifs pendant la synthèse.
* isotopes: Typiquement ³²p-utp ou ³⁵s-utp .
* Avantages: Peut produire des sondes d'ARN hautement marquées pour des études d'hybridation.
* Inconvénients: Nécessite des réactifs et des conditions spécialisés pour la transcription in vitro.
Le choix de la méthode d'étiquetage dépend de l'application spécifique et des propriétés souhaitées de l'ADN marqué.
Remarque: L'utilisation d'isotopes radioactifs a diminué ces dernières années en raison de problèmes de sécurité et de la disponibilité de méthodes d'étiquetage non radioactives. Cependant, l'étiquetage radioactif présente encore certains avantages dans certaines applications, en particulier pour la sensibilité et la capacité de détecter des cibles abondantes faibles.
