La minéralisation est médiée par les ostéoblastes, qui sécrètent des précurseurs minéraux à travers des vésicules matricielles (VM) en tant que processus fondamental chez les vertébrés. Les vésicules sont riches en calcium et en phosphate, contenant des matières organiques telles que des protéines acides. Dans une nouvelle étude maintenant publiée dans Avancées scientifiques , Tomoaki Iwayama et ses collègues des départements de parodontologie, recherche biomédicale, sciences orales, le développement des biomatériaux et de l'anatomie buccale a utilisé la microscopie diélectrique assistée par électrons (SE-ADM) et la microscopie à super-résolution (SRM) pour évaluer les ostéoblastes vivants dans des conditions de minéralisation à une résolution de niveau nano. Ils ont découvert que les vésicules contenant du calcium étaient des corps multivésiculaires contenant des nanovésicules minéralisantes ou des vésicules matricielles (VM). D'après les constats, les MV pourraient être transportés avec les lysosomes et sécrétés par exocytose. Iwayama et al. a présenté la preuve que les lysosomes pouvaient transporter du phosphate de calcium amorphe dans les cellules ostéoblastiques en minéralisation.

Au cours du processus physiologique de minéralisation osseuse, le dépôt de cristaux de phosphate de calcium se produit dans la matrice extracellulaire en tant que processus fondamental chez tous les vertébrés. En 1967, les biologistes Clarke Anderson et Ermanno Bonucci, particules liées aux minéraux visualisées individuellement dans l'espace extracellulaire à l'aide de la microscopie électronique (EM). Les scientifiques ont reconnu plus tard ces particules comme des nano-vésicules minéralisantes ou des vésicules matricielles (VM). Au cours des 50 dernières années d'études EM sur les MV, les biologistes se sont efforcés de comprendre le mécanisme de formation et de sécrétion du MV, qui reste largement méconnu.

Clarifier le processus de minéralisation des cellules vivantes avec l'EM est un défi car la préparation des échantillons pour l'EM nécessite des étapes à la fois sur la fixation chimique et la déshydratation alcoolique. Les étapes peuvent induire des artefacts et même dissoudre ou éliminer des précurseurs minéraux instables en laissant un échafaudage organique connu sous le nom de « fantôme de cristal ». Alors que les scientifiques avaient utilisé avec succès le processus d'EM utilisant des tissus fixés et déshydratés pour visualiser la structure des fibrilles de collagène minéralisées dans les os, étudier les précurseurs minéraux, ils doivent utiliser des procédés cryo-EM pour éviter la déshydratation et faciliter les coûteux, refroidissement extrêmement rapide avec de petits échantillons.

Pour surmonter ces limites dans le présent travail, Iwayama et al. a utilisé un nouveau système microscopique connu sous le nom de microscopie diélectrique assistée par électrons (SE-ADM). La méthode avait déjà atteint une résolution à l'échelle nanométrique et une imagerie à contraste élevé pour les cellules de mammifères dans des milieux aqueux sans coloration. Les scientifiques ont utilisé la même technique (SE-ADM haute résolution) pour explorer la possibilité de visualiser des MV dans des ostéoblastes intacts afin de comprendre la biogenèse du trafic de MV. Pour la lignée cellulaire ostéoblastique, ils ont utilisé la lignée cellulaire ostéoblastique murine (souris) KUSA-A1, à haute capacité ostéogénique in vitro et in vivo. Après culture cellulaire dans des conditions adéquates, Iwayama et al. observé les cellules avec SE-ADM pour identifier les structures intracellulaires normales. Les scientifiques ont observé que les VM s'alignaient sur les fibrilles de collagène après 4 à 10 jours de croissance cellulaire dans des milieux ostéogéniques et que la taille des particules sécrétées augmentait en raison de la fusion ou de la croissance des particules. avec leurs tailles cohérentes avec les rapports précédents pour suggérer qu'il s'agissait bien de MV.

Après un examen plus approfondi avec SE-ADM, ils ont noté l'implication de la voie lysosomale pour transporter et sécréter les VM intraluminales dans un processus similaire à celui des exosomes. De façon intéressante, les exosomes et les VM sont classés comme des vésicules extracellulaires de tailles similaires ; ils sont tous deux sécrétés par les ostéoblastes et ont des fonctions communes lors de la communication cellule-cellule.

A l'étape suivante, Iwayama et al. examiné si ces particules étaient des VM contenant du calcium et/ou du phosphate. Pour ça, ils ont cultivé les cellules dans des milieux ostéogéniques pendant 7 jours et les ont observées en utilisant SE-ADM pour enregistrer des structures très lisses sans facettes cristallines. Cela suggère que les MV ne se sont pas cristallisés mais sont restés amorphes, comme cela a également été enregistré dans une étude précédente. Lorsque les scientifiques ont examiné les MV sur un film de SiN (mononitrure de silicium), ils ont observé des pics nets correspondant au phosphore, calcium, éléments de carbone et d'oxygène. Ils ont confirmé les résultats en utilisant la spectroscopie Raman pour montrer la présence de phosphate de calcium dans les VM.

Les scientifiques ont également étudié les effets de l'hypophosphatasie, une condition médicale codée par le Gène Alpl (phosphatase alcaline) , où les ostéoblastes ne subissent pas de minéralisation in vitro. Pour ça, ils ont édité le génome des cellules ostéoblastiques à l'aide de la technologie d'édition du génome CRISPR-Cas9 pour générer des clones d'ostéoblastes knock-out Alpl. Quand Iwayama et al. examiné les clones knock-out à l'aide de SE-ADM haute résolution, ils n'ont pas observé de MV, ce qui a été confirmé par une analyse spectrométrique en raison de l'absence de pics de phosphore et de calcium.

Après avoir observé directement la production et la sécrétion de VM à l'aide de SE-ADM, les scientifiques ont en outre étudié l'implication des lysosomes dans le trafic intracellulaire des MV pour observer la minéralisation des ostéoblastes vivants. Ils ont cultivé les cellules dans des milieux ostéogéniques contenant du calcium et les ont colorées avec LysoTracker pour détecter les composants intracellulaires d'intérêt. Iwayama et al. localisé les vésicules remplies de calcéine correspondant aux lysosomes pour suggérer la biogenèse des MVs dans les lysosomes après leur fusion avec la calcéine ⁺ vésicules. Les scientifiques ont suivi les expériences avec des études de perte de fonction et d'inhibition fonctionnelle pour déconstruire davantage les voies et examiner les mécanismes d'action intracellulaires pendant la minéralisation des cellules vivantes in vitro.

Scientists had previously reported the involvement of mitochondria during mineralization due to the presence of electron-dense calcium and phosphorous-rich granules in osteoblast mitochondria. This was observed with a modified cryotechnique. Par ailleurs, reports also suggest the direct contact of lysosomes and mitochondria with functional significance. When Iwayama et al. stained cells with LysoTracker together with MitoTracker and observed the intracellular components under N-SIM structured illumination super-resolution microscopy (SRM). They observed the presence of most calcein-fulfilled vesicles next to mitochondria and matched with lysosomes. During SRM-time lapse imaging, the scientists further obtained views of intracellular transport of LysoTracker containing vesicles fused to static calcein vacuoles adjacent to mitochondria to validate their hypothesis.

De cette façon, together with observations of other SRM systems and additional cell lines, Tomoaki Iwayama and colleagues proposed a mineralization mechanism. Wherein lysosomes played a central role in intracellular MV biogenesis and trafficking within osteoblasts. It was reasonable to involve lysosomes for osteoblasts to transport amorphous calcium phosphate without crystallization during its transport in the cytosol. The scientists aim to conduct further experiments to understand the regulatory molecules for MVs and investigate if MVs and exosomes have similar constitutions and mechanism underlying their generation, secretion and function. The SE-ADM strategy used in the present work can be installed into existing scanning electron microscopy apparatus at a low cost. The work developed in the study will offer non-invasive, high-resolution imaging at the nanoscale applicable to all scientific fields.

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