Structure moléculaire du nouvel agent de marquage fluorescent proche infrarouge PREX 710 avec un site de liaison pour une biomolécule. L'incorporation de la fraction d'oxyde de phosphine (P=O) électroattracteur dans la charpente du xanthène permet un décalage vers le rouge (augmentation de la longueur d'onde) des longueurs d'onde d'excitation et d'émission. Les deux groupes méthoxy (OMe) sur le cycle aromatique contribuent à l'amélioration de la stabilité chimique et de la photostabilité de PREX 710. Diverses biomolécules peuvent être liées à PREX 710 en position R via une liaison amide. Crédit :Université de Nagoya
Un groupe de chimistes de l'Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Université de Nagoya, a développé un nouveau colorant fluorescent photostable émettant dans le proche infrarouge (NIR) PREX 710 (colorant xanthène photo-résistant qui peut être excité à 710 nanomètres) pour avoir des utilisations allant de l'imagerie de molécule unique à long terme à l'imagerie profonde in vivo, selon une étude publiée dans la revue Angewandte Chemie Édition Internationale .
PREX 710 a une structure moléculaire constituée d'un fragment d'oxyde de phosphine (P=O) à la place de l'oxygène dans son noyau de xanthène tricyclique fusionné, et 2 groupes méthoxy (OMe) sur le cycle aromatique périphérique, qui permet au colorant d'absorber et d'émettre dans la région NIR, et rend compte de sa haute stabilité chimique et de photostabilité, respectivement. En outre, l'ester PREX 710 NHS peut être chimiquement lié à des biomolécules dont des protéines, sucres, et de petits ligands organiques, ce qui peut conduire à des observations de diverses structures et événements dans les cellules vivantes.
En collaboration avec les chercheurs du RIKEN et de l'Université d'Ehime, l'équipe a découvert que PREX 710 pouvait être utilisé pour l'imagerie par fluorescence d'une seule molécule dans des conditions physiologiques. La photostabilité élevée du PREX 710 permet une imagerie répétée, et ses propriétés spécifiques d'absorption/émission de lumière dans la région NIR, permet une imagerie multicolore grâce à son utilisation avec d'autres colorants fluorescents. De plus, en liant l'ester PREX 710 NHS à un polysaccharide (dextrane), l'équipe a réussi à réaliser une imagerie 3D profonde in vivo des vaisseaux sanguins dans le cerveau de souris. Ceci a été rendu possible par la stabilité chimique élevée du PREX 710 dans la circulation sanguine, ainsi que par l'utilisation du rayonnement NIR pour regarder profondément à l'intérieur des tissus. La haute photostabilité, solubilité dans l'eau et stabilité chimique, avec sa faible cytotoxicité, et l'utilisation du rayonnement NIR fait du PREX 710 un outil puissant pour visualiser les processus et les structures moléculaires pendant de longues durées sans photoblanchiment à l'intérieur des organismes vivants.
L'imagerie par fluorescence est une technique où une protéine ou un organite cellulaire spécifique est marqué avec une sonde fluorescente et est utilisé pour visualiser les processus et les structures des organismes sous un microscope à fluorescence. Bien que de nombreux agents de marquage fluorescents, telles que les protéines fluorescentes et les petites molécules organiques fluorescentes ont été développées jusqu'à présent, la plupart d'entre eux utilisent des rayonnements dans la région visible. Les inconvénients de l'utilisation de la lumière visible comme les lumières bleues ou vertes découlent de sa haute énergie, qui peuvent endommager les échantillons vivants lorsqu'ils sont exposés pendant de longues périodes. En outre, lorsque les échantillons sont excités avec de la lumière visible, l'autofluorescence des échantillons eux-mêmes a tendance à interférer avec les signaux des sondes fluorescentes. Il est également connu que les biomolécules telles que l'hémoglobine ont tendance à absorber la lumière visible, pour que la lumière ne pénètre pas profondément à l'intérieur des organismes, ce qui a rendu difficile la visualisation des vaisseaux sanguins et des organes vivants.
Une comparaison de la photostabilité de PREX 710 et Alexa Fluor 647 (colorant cyanine) en utilisant l'imagerie fluorescente à molécule unique. Les colorants fluorescents ont été conjugués à la NeutrAvidin immobilisée sur une surface de verre biotinylée. Chaque point lumineux indique un signal de fluorescence d'une seule molécule. Dans la lamelle avec Alexa Fluor 647, la moitié des signaux disparaissent en 20 secondes. D'autre part, la lamelle avec PREX 710 conserve 80% des signaux même après 2 minutes. Crédit :Université de Nagoya
Ces problèmes liés à l'imagerie avec la lumière visible pourraient être surmontés en utilisant le rayonnement NIR, qui a une longueur d'onde plus longue, donc moins d'énergie, par rapport à la lumière visible. Néanmoins, bon nombre des colorants NIR développés jusqu'à présent sont à base de colorants cyanine, qui se composent de chaînes polyméthine (groupes méthine (CH) reliés par des liaisons simples et doubles alternées) qui ont des hétérocycles azotés attachés à chaque extrémité de la chaîne. La majorité des colorants à base de cyanine souffrent d'une faible stabilité chimique et de photostabilité, rendant ainsi la bio-imagerie à long terme difficile avec ces colorants en raison du photoblanchiment au fil du temps. Bien que des agents anti-décoloration puissent être ajoutés pour empêcher le photoblanchiment, ils peuvent ne pas être applicables dans les expériences de cellules vivantes.
"Le groupe Yamaguchi s'est intéressé à la fabrication de colorants photostables pour la bio-imagerie qui absorbent et émettent dans différentes longueurs d'onde, " dit le Dr Masayasu Taki, professeur associé dans le groupe du professeur Shigehiro Yamaguchi à l'ITbM, et l'un des chefs de file de cette étude. « On sait que les longueurs d'onde d'excitation et d'émission des colorants augmentent avec une augmentation des doubles liaisons conjuguées dans sa structure, mais plus d'anneaux rend la synthèse compliquée et conduit également à une faible solubilité dans l'eau, ce qui n'est pas idéal pour l'imagerie dans des conditions physiologiques. Nous avons donc décidé de synthétiser différents colorants en changeant les éléments du noyau xanthène de l'oxygène au phosphore."
"Dr Marek Grzybowski, un chercheur postdoctoral dans notre groupe, a travaillé sur ce projet, et a conçu les synthèses de nombreux colorants fluorescents à base de rhodamine récemment développés dans notre groupe, " décrit Taki.
Au cours de leurs études, le groupe a également constaté que l'un des dérivés du PREX 710 était susceptible d'attaquer une forme réduite de glutathion (GSH), qui est un tripeptide qui agit comme un antioxydant dans les cellules. Bien que la décoloration des colorants par le GSH soit généralement considérée comme un inconvénient en imagerie fluorescente en direct, le groupe a pensé que ce colorant pourrait servir de sonde NIR prometteuse pour surveiller le niveau de GSH dans les cellules et les tissus vivants.
Exemples d'imagerie fluorescente utilisant PREX 710. L'image de gauche montre la membrane cellulaire d'une cellule HeLa vivante (cyan), noyau (jaune vert) et mitochondries (rouge) colorés au DiI, SiR-ADN et PREX 710, respectivement. PREX 710 peut être utilisé simultanément avec des sondes fluorescentes disponibles dans le commerce pour permettre une imagerie multicolore. L'image 3D à droite montre des vaisseaux sanguins dans un cerveau de souris coloré avec un conjugué PREX 710-dextrane qui a été injecté dans la circulation sanguine. Crédit :Université de Nagoya
"Après avoir synthétisé et testé divers dérivés du xanthène, nous avons trouvé PREX 710, qui présentait une stabilité chimique et photostabilité exceptionnelle, et s'est donc avéré être un fluorophore émissif NIR pratique, elle-même perméable à la membrane et localisée principalement dans les mitochondries des cellules HeLa vivantes, " explique Taki. " Nous étions vraiment ravis de voir qu'en utilisant PREX 710, nous pouvions visualiser les composants des cellules vivantes pendant plusieurs minutes par rapport à seulement quelques secondes qui pourraient être obtenues avec des colorants conventionnels."
En collaboration avec le Dr Yasushi Okada, un chef d'équipe au RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, l'équipe a trouvé que PREX 710 était applicable pour l'imagerie par fluorescence d'une molécule unique, une technique connue pour nécessiter un fort rayonnement lumineux. Leurs études montrent que dans les mêmes conditions expérimentales, 80% des signaux fluorescents monomoléculaires du PREX 710 ont pu être détectés pendant 2 minutes, alors que la moitié des signaux ont disparu en 20 secondes avec Alexa Fluor 647 (colorant cyanine). Les expériences démontrent que PREX 710 peut clairement visualiser chaque molécule pendant des périodes prolongées sans aucun photoblanchiment en l'absence d'agents anti-décoloration.
En outre, l'équipe a pu utiliser PREX 710 dans l'imagerie multicolore de cellules HeLa vivantes. Étant donné que les propriétés d'excitation et d'émission NIR du PREX 710 diffèrent des colorants fluorescents à lumière visible, la diaphonie spectrale peut être évitée afin de visualiser les composants cellulaires chacun colorés avec des colorants différents. Par exemple, l'imagerie multicolore des cellules HeLa vivantes était possible lors de la coloration de la membrane cellulaire, noyau et mitochondries avec des colorants fluorescents disponibles dans le commerce tels que DiI et SiR-DNA, avec PREX 710, respectivement.
L'utilité pratique de PREX 710 a également été démontrée en appliquant la sonde pour l'imagerie profonde in vivo, qui a été réalisé en collaboration avec les Drs. Takeshi Imamura et Ryosuke Kawakami de l'université d'Ehime. En utilisant le site de bioconjugaison de PREX 710, dextrane, un polysaccharide composé de molécules de glucose, a été marqué par fluorescence et injecté dans la circulation sanguine via la veine de la queue de souris. L'image 3-D des vaisseaux sanguins dans le cerveau de souris a pu être construite en raison de la haute luminosité de PREX 710 dans la région NIR qui permet l'enregistrement des signaux de fluorescence dans les tissus profonds.
"Nous avons eu le plaisir de démontrer que PREX 710 et ses dérivés sont des outils utiles pour l'étude de la dynamique des organismes vivants, tissus, cellules, et molécules, " dit Taki. " Nous travaillons actuellement sur le développement d'autres sondes de fluorescence NIR qui pourraient être utilisées pour colorer des protéines spécifiques ainsi que pour examiner des structures et des processus vivants plus en profondeur. Nous espérons que cela conduira à la visualisation et à l'élucidation de divers phénomènes dans les systèmes vivants, y compris les symptômes médicaux, " il dit.
