Par John Brennan
Mis à jour le 24 mars 2022
L’électrophorèse sur gel reste le cheval de bataille des laboratoires de biologie moléculaire. En appliquant un champ électrique, l’ADN et les protéines sont séparés, généralement selon leur taille, au sein d’une matrice de gel. Bien que la technique soit courante, la façon dont les résultats sont interprétés varie en fonction de l'application en aval, qu'il s'agisse d'un transfert Western, d'un transfert Northern, d'un transfert Southern ou d'une simple analyse sur agarose.
Lorsque vous travaillez avec des gels d'agarose, deux tâches dominent :1) distinguer les plasmides non coupés, entaillés et linéaires de votre insert, et 2) estimer la taille des fragments à l'aide d'une courbe standard fiable. Les étapes suivantes vous guident tout au long de ce processus de manière claire et reproductible.
Consultez votre carnet de laboratoire pour confirmer quel échantillon a été chargé dans chaque voie. Les étiquettes de voie que vous avez enregistrées au moment du chargement constituent votre point de départ pour tous les calculs ultérieurs.
L'échelle contient des fragments de longueur connue. Ses distances de migration serviront de référence pour dimensionner vos bandes inconnues.
À l’aide d’une règle, mesurez la distance entre le puits et le colorant de suivi (le colorant qui se déplace le plus loin). Enregistrez cette valeur ; les unités sont arbitraires tant qu'elles sont cohérentes.
Mesurez la distance entre chaque bande d’échelle et le puits, puis divisez-la par la distance du colorant de suivi. Cela donne la mobilité relative (facteur de mobilité) pour chaque norme.
Exemple :Si le colorant de suivi a parcouru 6 pouces et que les bandes d'échelle ont parcouru 5, 4,5 et 3,5 pouces, les mobilités relatives sont de 0,833, 0,75 et 0,583.
Entrez les mobilités relatives et les tailles de fragments correspondantes (en kilobases) dans une feuille de calcul. Les fabricants fournissent généralement ces tailles dans la fiche technique de l'échelle.
Créez un graphique avec une mobilité relative sur l'axe X et une taille de fragment sur l'axe Y.
Utilisez la fonction Trendline pour ajuster une équation de loi de puissance (par exemple, y =ax^‑2). Visez un R² d'au moins 0,90 pour garantir une courbe fiable.
Les fragments plus petits migrent plus loin. Notez que les plasmides superenroulés (non coupés) voyagent plus loin que les fragments linéaires de même taille, tandis que les plasmides coupés migrent plus lentement.
Croisez les bandes de chaque piste avec l’échantillon que vous avez chargé. Pour un plasmide digéré avec deux enzymes, vous devriez voir deux bandes distinctes :une vers le haut (insert) et une vers le bas (plasmide coupé). Une digestion enzymatique unique devrait produire une seule bande qui se déplace légèrement plus loin que le plasmide non coupé mais beaucoup moins que l'insert.
Mesurez la distance entre le puits et chaque bande inconnue, divisez par la distance du colorant de suivi et obtenez la mobilité relative.
Insérez les mobilités relatives dans l'équation dérivée à l'étape 7 pour calculer la taille approximative de chaque fragment.
Si vous observez des bandes larges et brillantes au bas de chaque piste, vous avez probablement une contamination par l'ARN :revoyez vos étapes de purification.
