protéines membranaires internes (imps) :Ces protéines sont intégrées dans la membrane intérieure d'E. Coli, une bicouche phospholipide qui enferme le cytoplasme. Ils jouent un rôle crucial dans diverses fonctions cellulaires, notamment:
* Transport: Faciliter le mouvement des nutriments, des ions et des déchets à travers la membrane.
* Transduction du signal: Relliage des signaux de l'environnement à l'intérieur de la cellule.
* Métabolisme énergétique: Participer à des processus tels que le transport d'électrons et la synthèse de l'ATP.
Protéines membranaires externes (OMP) :Ces protéines sont situées dans la membrane externe d'E. Coli, une deuxième bicouche phospholipide qui entoure la membrane intérieure et fournit un soutien et une protection structurelles. Ils sont impliqués dans:
* Formation de porine: Création de canaux qui permettent le passage de petites molécules.
* Activité des récepteurs: Se lier à des molécules spécifiques et déclencher des réponses cellulaires.
* adhésion: S'attacher à des surfaces ou à d'autres cellules.
Voici une approche générale pour séparer ces types de protéines d'E. Coli:
1. Lyse cellulaire:
* lyse mécanique: Utilisez des méthodes telles que la sonication ou la presse française pour perturber la paroi cellulaire et libérer le contenu cellulaire.
* lyse chimique: Utilisez des détergents comme Triton X-100 ou SDS pour dissoudre les lipides membranaires.
2. Centrifugation différentielle:
* centrifugation à basse vitesse (10 000 x g): Cette étape élimine les débris cellulaires, y compris les cellules ininterrompues et les grands composants cellulaires.
* centrifugation à grande vitesse (100 000 x g): Cette étape sépare les membranes intérieures et externes du cytoplasme soluble. Le culot contenant les deux membranes est collecté.
3. Fractionnement de la membrane:
* Centrifugation du gradient de saccharose: Cette méthode sépare les membranes en fonction de leur densité. La membrane externe est généralement moins dense que la membrane intérieure, permettant leur séparation.
* partitionnement de phase Triton X-114: Cette technique utilise un détergent non ionique pour séparer les protéines en fonction de leur hydrophobicité. Les IMP sont plus hydrophobes que les OMP, conduisant à leur partitionnement dans la phase riche en détergents.
4. Purification:
* Chromatographie d'affinité: Cette technique utilise des ligands spécifiques qui se lient à la protéine cible, permettant sa séparation des autres protéines.
* chromatographie d'échange d'ions: Cette méthode sépare les protéines en fonction de leur charge.
* Chromatographie d'exclusion de taille: Cette technique sépare les protéines en fonction de leur taille.
5. Confirmation:
* SDS-PAGE: Cette technique d'électrophorèse sépare les protéines en fonction de leur poids moléculaire.
* Western blot: Cette technique utilise des anticorps pour détecter des protéines spécifiques.
Remarques importantes:
* Le protocole spécifique dépendra de la protéine cible et de ses propriétés.
* L'optimisation de chaque étape est cruciale pour obtenir des protéines pures et fonctionnelles.
* Des techniques comme la spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour une analyse plus approfondie des fractions de protéines séparées.
Kits commerciaux:
Plusieurs kits commerciaux sont disponibles pour l'isolement des protéines de la membrane interne et externe d'E. Coli, ce qui peut simplifier le processus.
En suivant ces étapes et en choisissant les techniques appropriées, les chercheurs peuvent séparer et purifier avec succès les protéines membranaires intérieures et externes d'E. Coli, permettant une analyse plus approfondie de leur structure, de leur fonction et de leur interaction.
