Par Tricia Lobo, mise à jour le 30 août 2022
Les enzymes accélèrent les réactions chimiques en réduisant l'énergie d'activation. La plupart des enzymes fonctionnent mieux entre 35°C et 40°C, une plage dans laquelle une énergie cinétique accrue améliore la liaison au substrat sans provoquer de dénaturation. Le dépassement de cette fenêtre peut déplier de manière irréversible la protéine et arrêter son activité.
Sélectionnez une méthode fiable pour quantifier la formation de produits à chaque point de température. Les options courantes incluent la spectrophotométrie (conversion de l'absorbance en concentration à l'aide d'une courbe d'étalonnage) ou les tests de fluorescence qui corrèlent l'intensité à la quantité de produit.
Combinez l’enzyme et le substrat dans un flacon à scintillation scellé pour éviter l’évaporation. Placez le flacon dans un plus grand bécher rempli d'eau et montez le bécher sur une plaque chauffante. Insérez un thermomètre calibré dans le bécher pour surveiller la température de la solution avec précision.
Commencez par prélever une aliquote de 100 µL à température ambiante (~25°C). Activez la plaque chauffante et collectez des échantillons de 100 µL à des températures incrémentielles (30,5 °C, 31 °C, 31,5 °C, etc.) jusqu'à atteindre 40 °C. Assurez-vous que chaque échantillon est traité immédiatement pour éviter la dérive de température.
Déterminez la concentration du produit pour chaque aliquote en utilisant le test choisi. Tracer la concentration (ou la vitesse de réaction) en fonction de la température. Le sommet de cette courbe identifie la température optimale de l’enzyme. Les températures supérieures à 40°C montrent généralement une baisse d'activité, indiquant le début d'une dénaturation.
