Les investigations optiques et les manipulations forment souvent le cœur des expériences biologiques. Dans un nouveau rapport maintenant publié dans Avancées scientifiques , Kazuki Okamato et une équipe de scientifiques en sciences pharmaceutiques, neurosciences, Médicament, physique et intelligence artificielle à l'Université de Tokyo, Japon, a introduit un nouveau matériau en verre borosilicaté contenant un ion de terre rare terbium (III) (Tb ³⁺ ). Le matériau a émis une fluorescence verte lors de l'excitation de la lumière bleue, un peu comme la protéine fluorescente verte (GFP) avec une large compatibilité dans les environnements de recherche biologique. A l'aide de micropipettes en verre dopé au terbium, Okamato et al. des cellules marquées GFP ciblées pour l'électroporation monocellulaire, analyse du transcriptome unicellulaire et expériences d'enregistrement patch-clamp sous contrôle microscopique de fluorescence en temps réel. Le verre a également montré une génération potentielle de troisième harmonique lors d'une excitation laser infrarouge, utile pour le ciblage optique en ligne des neurones marqués par fluorescence dans le néocortex in vivo. De cette façon, le verre dopé au terbium a simplifié de multiples procédures dans les expériences biologiques avec des applications plus larges dans la recherche biomédicale.

Mener des investigations optiques in vivo

Les investigations optiques et les manipulations cellulaires dans les tissus vivants sont répandues dans la recherche biologique avec la capacité de révéler diverses propriétés dans les cellules et au cours de la communication intracellulaire. Alors que le marquage génétique a permis l'identification de cellules exprimant des protéines fluorescentes, il reste difficile d'accéder aux cellules marquées par fluorescence à l'aide de pipettes en verre car le verre n'est pas fluorescent dans le domaine visible. Pour résoudre ces problèmes techniques, Okamato et al. introduit une nouvelle composition de verre borosilicaté. Les ions de terres rares présentaient une émission de fluorescence unique avec des pics nets dans le spectre de la lumière visible. L'équipe s'est concentrée sur le terbium (III) (Tb ³⁺ ), qui ont des structures de niveau d'énergie complexes et devraient théoriquement émettre une fluorescence verte. La longueur d'onde d'excitation était proche de la visibilité la plus élevée pour les yeux humains et proche de celle de la protéine fluorescente verte. Par conséquent, les pipettes en verres dopés au terbium étaient utiles pour la fluorescence ciblée, manipulation unicellulaire en sciences de la vie.

L'équipe a développé le verre borosilicaté en utilisant 3,1 pour cent en moles (% en moles) d'oxyde de terbium (Tb 2 O 3 ). Le terbium (Tb ³⁺ )-verre dopé émettant une fluorescence verte visible à l'œil nu, même sous la lumière de la pièce. La TB ³⁺ -le verre dopé avait un pic d'absorption à une longueur d'onde de 484 nm, ce qui n'a pas été observé dans le verre borosilicaté normal sans terbium. Les scientifiques ont produit des capillaires et des pipettes en verre où le verre moulé continuait à émettre une fluorescence verte. En utilisant la microscopie électronique à balayage, l'équipe a vérifié les pointes de pipette pour toute aberration qui pourrait affecter la qualité des enregistrements électrophysiologiques. Okamato et al. ont ensuite utilisé les nouvelles micropipettes pour effectuer l'électroporation unicellulaire d'une protéine fluorescente rouge (tdTomato) dans les neurones des structures organotypiques de tranches d'hippocampe de rat. Ils ont vu les pipettes contenant le vecteur de colorant rouge et les cellules pyramidales qui ont été minimalement marquées avec de la GFP améliorée, utilisant le même appareil optique. Les scientifiques ont attaché les pointes de pipette aux cellules et appliqué des impulsions électriques pour l'électroporation afin de faciliter l'expression du colorant rouge après 48 heures. Après, l'équipe a effectué un séquençage d'ARN unicellulaire avec les pipettes dans des tranches aiguës du cortex moteur primaire de souris transgéniques.

Utilisation des nouvelles micropipettes pour les enregistrements de patch-clamp in vitro

Les chercheurs ont ensuite effectué des enregistrements patch-clamp à partir de cultures primaires de neurones hippocampiques faiblement marqués avec de la GFP à l'aide d'une pipette dopée au terbium chargée d'un colorant fluorescent rouge (Alexa Fluor 594). Les pipettes ont rempli avec succès les cellules cibles avec le colorant et les ont maintenues dans la configuration de la cellule entière. L'équipe a appliqué la même méthode à des préparations de tranches de cerveau aiguës où les neurones étaient situés plus profondément dans des tissus moins transparents que les neurones en culture. Quand Okamato et al. cellules pyramidales patchées dans les tranches aiguës d'hippocampe à l'aide de pipettes dopées au terbium, les neurones ont montré des potentiels d'action normaux en réponse à de brèves injections de courant. Les cellules présentaient des courants post-synaptiques spontanés excitateurs et inhibiteurs normaux sous la configuration voltage-clamp. Les micropipettes pouvaient être utilisées pour des enregistrements stables à long terme et étaient également utiles pour les enregistrements à partir de neurites. L'équipe a enregistré des potentiels d'action de rétropropagation en utilisant la configuration des dendrites ciblées.

Enregistrements patch-clamp in vivo à l'aide de pipettes dopées au terbium

Okamato et al. next characterized the nonlinear multiphoton excitation of terbium-doped glass using infrared light at wavelengths that were approximately double the single-photon excitation peak (484 nm) of terbium. Using a photomultiplier tube through a 495-to-540 nm band-pass filter, the team captured the green fluorescence emitted by terbium-doped pipettes. The emissions peaked at an excitation wavelength of 975 nm, suggesting that a laser wavelength corresponding to the value excited the glass through a two-photon absorption process. The scientists also noted another bright signal at 1300 nm excitation through a 410-to-450 band pass filter and suggested the signal to have likely arisen from third harmonic generation (THG). Based on the strong THG signal of the micropipettes, Okamato et al. conducted in vivo whole cell patch-clamp recordings with a multiphoton laser microscope. They simultaneously used the cells and terbium-doped pipette using dual-laser irradiation at 1, 040 nm and 1, 300 nm, respectivement, and recorded the injection-induced action potentials and spontaneous membrane fluctuations under the current-clamp configuration.

De cette façon, Kazuki Okamato and colleagues invented a terbium-doped glass emitting green fluorescence signal strong enough to be visible to the naked eye. The material had similar characteristics to conventional borosilicate glass and did not display photobleaching or cytotoxicity. The new micropipettes allowed fluorescence manipulations such as optical targeting of single-cell electroporation, single-cell RNA sequencing and electrophysiological recordings. The glass also emitted third harmonic generation upon three-photon excitation, applicable for in vivo manipulation. The terbium-doped glass therefore provided a platform for multiple purposes in biomedical research including hitherto conventional patch-clamp recordings to open new frontiers in life sciences.

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