Le marquage de spin dirigé vers le site (SDSL) utilisé en combinaison avec la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) a été une technique éprouvée pour élucider la structure, fonction et dynamique des protéines et des complexes protéiques. Les étiquettes de centrifugation à base de nitroxyde sont parmi les plus populaires et les mieux établies car elles sont petites, non perturbant et présentent d'excellentes propriétés spectroscopiques. « Les procédures de marquage par centrifugation idéales présentent des taux de réaction et une sélectivité élevés, " explique le professeur Malte Drescher, Professeur de spectroscopie des systèmes complexes au département de chimie de l'Université de Constance et auteur principal de l'étude aux côtés du professeur Valentin Wittmann, spécialisé dans la synthèse organique.

« Atteindre une réactivité élevée et une sélectivité élevée à la fois peut être un problème, " poursuit Drescher. " Les étiquettes de filage conventionnelles par exemple, sur Gadolinium(III) ou trityle, afficher soit des spectres très larges et de faibles profondeurs de modulation, soit des spectres très étroits qui ne conviennent pas aux types d'expériences que nous voulons mener." Une nouvelle étude publiée par Drescher, Wittmann et leur équipe de chimistes de l'Université de Constance, qui a été publié en ligne dans la revue Communications ChemBioChem le 14 août 2019, introduit une nouvelle approche pour le marquage des protéines qui comprend des marqueurs de spin à base de nitroxyde et des acides aminés non canoniques génétiquement codés (ncAA) comme cibles pour le SDSL.

"Les nitroxydes offrent une largeur spectrale idéale et un accès à des informations dynamiques, " dit Anandi Kugele, doctorant à la Konstanz Research School of Chemical Biology (KoRS-CB) et premier auteur de l'étude, qui a reçu une prestigieuse bourse de voyage du National High Magnetic Field Laboratory pour présenter les résultats à la conférence Rocky Mountain 2019 sur la résonance magnétique à Denver, Colorado (États-Unis). « Les étiquettes traditionnelles à base de nitroxyde ont une stabilité redox limitée, ce qui est un inconvénient pour les applications en cellule. Le défi pour nous était d'augmenter la stabilité du nitroxyde et donc d'adapter les marqueurs de spin à base de nitroxyde pour une future utilisation de routine in vivo. les chercheurs ont développé un nouveau marqueur de spin qui peut être attaché aux protéines au moyen de la cycloaddition Diels-Alder (DAinv) à demande d'électrons inverses aux ncAA génétiquement codés, une méthode qui s'est avérée adaptée à une large gamme d'applications in vitro et in vivo. Pour obtenir la stabilité du nitroxyde, les chercheurs ont en outre utilisé une stratégie de protection basée sur des groupes protecteurs photoamovibles, qui sont connus pour protéger les nitroxydes et les libérer au besoin.

Le nouveau marqueur de spin, appelé nitroxyde photoactivable pour la réaction DAinv, ou PaNDA en abrégé - est soluble dans l'eau, EPR-actif et efficace de déprotection à la fois dans les tests in vitro et dans les lysats avec les deux protéines modèles Green Fluorescent Protein (GFP) et Escherichia coli oxydoréductase thiorédoxine (TRX), qui se trouve dans pratiquement tous les organismes connus, suggérer. « Nous devons améliorer la méthode utilisée pour fournir le marqueur de spin PaNDA aux cellules et pour tester l'efficacité de l'étiquetage et de la déprotection à l'intérieur de la cellule, entre autres choses, " conclut Malte Drescher :" Mais nos recherches démontrent clairement que, en principe, le label PaNDA peut être utilisé pour les mesures EPR dans des environnements biologiques difficiles, y compris l'intérieur des cellules. Nos tests avec le lysat d'E. coli sont très prometteurs à cet égard. Cela ouvrira une toute nouvelle gamme d'opportunités pour l'étude des protéines au moyen de la spectroscopie EPR."