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Les membranes cellulaires sont composées de bicouches phospholipidiques contenant des protéines intégrées qui assurent les fonctions cellulaires essentielles. La microscopie optique traditionnelle ne peut pas résoudre les protéines membranaires individuelles. La fracture par gel, combinée à la microscopie électronique, nous permet de diviser les membranes gelées le long de leur bicouche, exposant ainsi la répartition des protéines dans la matrice lipidique. En intégrant des techniques de marquage supplémentaires, les chercheurs peuvent cartographier des protéines spécifiques, ainsi que des composants bactériens et viraux, avec une précision inférieure au nanomètre.
1. Congelez rapidement les cellules ou les tissus dans de l'azote liquide pour immobiliser les structures.
2. Utilisez un microtome pour fracturer l'échantillon congelé ; la membrane se fend entre les deux feuillets phospholipidiques là où les interactions hydrophobes sont les plus faibles.
3. Effectuez une gravure par congélation sous vide poussé pour éliminer les cristaux de glace, préservant ainsi les détails fins.
4. Ombrez la face de fracture avec un mince film de carbone et de platine pour créer une réplique stable qui suit la topologie de la membrane.
5. Digérez les matières organiques résiduelles avec de l'acide, laissant une coque en platine qui représente la surface exposée de la membrane.
6. Examinez la réplique par microscopie électronique à transmission (MET) pour une analyse structurelle.
La gravure par gel élimine les cristaux de glace qui autrement obscurciraient les détails de la membrane. Le processus de séchage sous vide préserve l'architecture native et permet l'observation des activités dynamiques des membranes, des organites intracellulaires et des assemblages viraux.
La microscopie électronique à transmission offre un grossissement jusqu'à 1 million de fois et des résolutions allant jusqu'à 3 nm, ce qui en fait la modalité privilégiée pour les répliques de cryofracture. La microscopie électronique à balayage (MEB) est moins couramment utilisée dans ce contexte, mais peut fournir une topologie de surface de spécimens plus grands.
Depuis son introduction il y a plus de cinquante ans, la TEM par congélation a joué un rôle déterminant dans la confirmation du modèle de bicouche lipidique de la membrane plasmique et dans l'élucidation de la disposition spatiale des protéines intégrales, périphériques et ancrées dans les lipides. La technique révèle si les protéines sont des « flotteurs » qui dérivent dans la bicouche ou des « ancres » qui s’étendent sur les deux feuillets, et elle peut détecter l’agrégation ou le regroupement de protéines. Lorsqu'ils sont associés au marquage immunogold (des anticorps marqués avec des particules denses aux électrons), les chercheurs peuvent identifier des protéines spécifiques et déduire leurs rôles fonctionnels.