Par Sarah Quinlan
Mis à jour le 30 août 2022
Selon BioWeb de l'Université du Wisconsin, une amorce PCR est un court oligonucléotide synthétique - généralement de 18 à 25 nucléotides de long - utilisé pour amplifier des segments d'ADN spécifiques via une réaction en chaîne par polymérase (PCR). Les amorces directes et inverses, conçues comme compléments inverses, flanquent la région cible pour faciliter l'amplification. Lorsque les chercheurs ciblent un gène ou une région d’ADN spécifique, la PCR génère suffisamment de matériel pour les analyses en aval. Si des amorces appropriées ne sont pas disponibles dans la littérature publiée ou dans des sources commerciales, la conception d'amorces personnalisées devient essentielle.
Commencez par récupérer la séquence nucléotidique de votre gène cible ou de votre région d'ADN et décidez de la longueur du fragment que vous souhaitez amplifier. La PCR conventionnelle amplifie les fragments entre 100 et 1 000 paires de bases, tandis que la PCR en temps réel cible généralement 50 à 200 paires de bases.
Déterminez où dans la séquence vos amorces se lieront :près de l'extrémité 5 ′ ou 3 ′, au milieu ou s'étendant sur un intron si vous le souhaitez.
Adhérer aux lignes directrices établies en matière de conception d'amorces ; le succès de l'amplification dépend de la qualité de l'amorce et des paramètres clés.
Concevoir des amorces de 18 à 24 nucléotides de long. Le Dr Vincent R. Prezioso, Ph.D., de Brinkmann Instruments recommande cette gamme pour une spécificité optimale et un recuit efficace. Ciblez une température de fusion (Tm) de 55 à 80 °C, une teneur en GC de 40 à 60 % et une pince GC à l’extrémité 3’. Évitez trois bases G/C ou plus dans les cinq dernières positions pour réduire les liaisons non spécifiques.
Évitez les séries de quatre nucléotides identiques ou plus ou les répétitions de dinucléotides, car cela peut conduire à un amorçage erroné. Veiller à l'absence de complémentarité intra-amorce ou inter-amorce pouvant former des auto-dimères ou des amorces-dimères.
Utilisez des outils en ligne réputés :Primer3 du MIT. , Primer‑Blast du NCBI , et OligoAnalyzer d'IDT —pour évaluer les propriétés des amorces et prédire les structures secondaires.