Par Palmer Owyoung
Mis à jour le 30 août 2022
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Le code génétique d’une cellule réside dans son ADN, qui reste enfermé dans le noyau. Pour étudier l’expression des gènes ou générer des bibliothèques d’ADN complémentaires (ADNc), l’ADN doit d’abord être transcrit en ARN messager (ARNm). L'isolement d'ARNm de haute qualité est essentiel pour détecter les transcrits rares, concevoir des sondes de puces à ADN et construire des bibliothèques d'ADNc.
Commencez par remettre en suspension les cellules granulées dans le réactif TRIzol (Life Technologies) ou une solution équivalente de phénol-guanidine telle que le réactif TRI d'Ambion. Ce réactif lyse simultanément les cellules, dénature les protéines et protège l'ARN de la dégradation enzymatique.
Effectuez une série de centrifugations pour séparer les composants cellulaires en phases distinctes. Jetez la couche supérieure jaune et riche en graisse. Recueillez la phase aqueuse rouge, qui contient la population complète d’ARN (ARNm, ARNt, ARNr et ARN non codants). Suivez le protocole d’extraction au phénol‑chloroforme, puis lavez le culot d’ARN avec de l’isopropanol et de l’éthanol. Ajoutez des inhibiteurs de RNase partout pour préserver l'intégrité de l'ARN.
Les kits commerciaux fournissent la purification d’ARNm la plus reproductible. Les choix populaires incluent le FastTrack 2.0 d'Invitrogen et le kit d'isolation d'ARNm Poly(A)Pure d'Ambion. Un protocole de kit typique se déroule comme suit :
Gardez tous les réactifs, cellules et ARN extraits au froid en les plaçant sur la glace. Les conditions froides inhibent l'activité RNase libérée lors de l'homogénéisation.
Le TRIzol et les réactifs phénol‑guanidine similaires sont toxiques. Évitez tout contact avec la peau et les muqueuses et respectez strictement les protocoles de sécurité institutionnels.