Par Palmer Owyoung
Mis à jour le 30 août 2022

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Le code génétique d’une cellule réside dans son ADN, qui reste enfermé dans le noyau. Pour étudier l’expression des gènes ou générer des bibliothèques d’ADN complémentaires (ADNc), l’ADN doit d’abord être transcrit en ARN messager (ARNm). L'isolement d'ARNm de haute qualité est essentiel pour détecter les transcrits rares, concevoir des sondes de puces à ADN et construire des bibliothèques d'ADNc.

Isolement de l'ARNm de l'ARN total

Étape 1 – Homogénéisation du TRIzol

Commencez par remettre en suspension les cellules granulées dans le réactif TRIzol (Life Technologies) ou une solution équivalente de phénol-guanidine telle que le réactif TRI d'Ambion. Ce réactif lyse simultanément les cellules, dénature les protéines et protège l'ARN de la dégradation enzymatique.

Étape 2 – Isolement total de l'ARN

Effectuez une série de centrifugations pour séparer les composants cellulaires en phases distinctes. Jetez la couche supérieure jaune et riche en graisse. Recueillez la phase aqueuse rouge, qui contient la population complète d’ARN (ARNm, ARNt, ARNr et ARN non codants). Suivez le protocole d’extraction au phénol‑chloroforme, puis lavez le culot d’ARN avec de l’isopropanol et de l’éthanol. Ajoutez des inhibiteurs de RNase partout pour préserver l'intégrité de l'ARN.

Étape 3 – Extraction de l'ARNm

Les kits commerciaux fournissent la purification d’ARNm la plus reproductible. Les choix populaires incluent le FastTrack 2.0 d'Invitrogen et le kit d'isolation d'ARNm Poly(A)Pure d'Ambion. Un protocole de kit typique se déroule comme suit :

• Combinez jusqu'à 300 µL d'ARN total avec le tampon de lyse inhibé par la RNase du kit.
• Chauffez à 65 °C pendant 5 minutes, puis refroidissez rapidement sur de la glace.
• Ajoutez du NaCl 0,5 M et dissolvez l'oligo‑dT (acide oligodésoxythymidylique) fourni dans le mélange.
• Centrifuger et récupérer le surnageant ; lier l'ARNm à la matrice de silice fournie.
• Laver plusieurs fois avec un tampon de liaison à faible teneur en sel, puis avec un tampon de lavage.
• Éluez l'ARNm dans le volume spécifié (généralement ~ 500 µL).
• Précipiter l'éluat avec de l'acétate de sodium et de l'éthanol, puis remettre en suspension dans 10 à 20 µL d'eau traitée au DEPC.
• Conserver à –80 °C et évaluer la concentration et la pureté à l'aide d'un spectrophotomètre UV.

Choses nécessaires

• Cabinet à flux laminaire
• Équipement de protection individuelle (sarrau, gants, protection oculaire)
• Pipettes, embouts, conteneurs pour déchets biologiques
• Centrifugeuse à grande vitesse, bloc thermique
• Surfaces de banc sans ARN
• Réactifs RNAzap ou RNAoff
• Kits commerciaux d'extraction d'ARNm (Invitrogen, Ambion, etc.)
• Acétate de sodium, éthanol, isopropanol
• Eau traitée au DEPC
• Spectrophotomètre UV et consommables
• Cellules adaptées à l'extraction d'ARN
• TRIzol ou réactif TRI
• Inhibiteurs de la RNase

TL;DR

Gardez tous les réactifs, cellules et ARN extraits au froid en les plaçant sur la glace. Les conditions froides inhibent l'activité RNase libérée lors de l'homogénéisation.

Avertissement

Le TRIzol et les réactifs phénol‑guanidine similaires sont toxiques. Évitez tout contact avec la peau et les muqueuses et respectez strictement les protocoles de sécurité institutionnels.

Références

• « Protocoles de bibliothèque d'ADNc » ; Ian G. Cowell et Caroline A. Austin, 1997
• « Protocoles de transcription et de traduction in vitro » ; Martin J. Tymms, 1995