1. Isoler l'ARNm du foie
* Collection de tissus: Le scientifique obtiendrait des tissus hépatiques d'un animal (idéalement une espèce similaire à la grenouille, mais il peut s'agir d'une espèce différente si nécessaire).
* Extraction d'ARN: Ils utiliseraient des techniques standard pour extraire l'ARN total du tissu hépatique. Cet ARN comprendrait à la fois l'ARNm et d'autres types d'ARN.
* Isolement de l'ARNm: Ils purifieraient ensuite l'ARNm en utilisant une technique appelée sélection Poly-A. Ce processus exploite le fait que la plupart des ARNm ont une queue Poly-A à l'extrémité 3 '.
2. Création d'une bibliothèque d'ADNc
* transcription inverse: En utilisant la transcriptase inverse, le scientifique convertirait l'ARNm isolé en ADN complémentaire (ADNc). Cet ADNc représente les séquences de codage des gènes exprimés dans le foie.
* Clonage: Les molécules d'ADNc seraient clonées dans un vecteur (par exemple, un plasmide ou un bactériophage) pour créer une bibliothèque d'ADNc. Cette bibliothèque stocke essentiellement tous les gènes exprimés dans le foie.
3. Identification du gène d'intérêt
* Séquençage d'ARNm (RNA-Seq): Le scientifique pourrait séquencer tous les ARNm dans le foie. En comparant les séquences à une base de données de gènes connus, ils peuvent identifier l'ARNm qui code la protéine d'intérêt.
* Affichage différentiel ou analyse de microréseaux: Ces techniques permettent au scientifique de comparer les modèles d'expression génique dans le foie (où la protéine est produite) à d'autres tissus. Cela peut aider à identifier les gènes spécifiquement exprimés dans le foie.
* Dépistage des anticorps: Si la protéine est déjà connue, le scientifique pourrait utiliser des anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine pour filtrer la bibliothèque d'ADNc. Cela identifiera directement le clone d'ADNc qui codes pour la protéine.
4. Expression dans les cellules de grenouille
* Clonage des gènes: Le gène codant pour la protéine d'intérêt, désormais identifié dans la bibliothèque d'ADNc, doit être isolé et cloné dans un vecteur qui peut être utilisé pour le livrer dans les cellules de grenouille.
* Choix du vecteur: Le vecteur doit contenir les éléments régulateurs nécessaires (promoteur, signal de polyadénylation) pour s'assurer que le gène est transcrit et traduit dans des cellules de grenouille.
* transfection / injection: Le vecteur contenant le gène est introduit dans les cellules de grenouille. Il existe différentes méthodes pour cela:
* Transfection: Utilisation de produits chimiques ou d'autres méthodes pour livrer le vecteur dans des cellules de grenouille en culture.
* Injection: Injecter directement le vecteur dans des embryons de grenouille ou en développement de tissus.
* Vérification: Le scientifique devra vérifier que la protéine est produite dans les cellules de grenouille:
* Immunofluorescence: En utilisant des anticorps fluorescents pour détecter la protéine à l'intérieur des cellules.
* Western blot: En utilisant des anticorps pour détecter la protéine dans les lysats cellulaires.
* tests fonctionnels: Tester si la protéine a l'activité biologique attendue dans les cellules de grenouille.
Considérations clés:
* Différences d'espèces: Bien que le gène puisse être trouvé dans une espèce différente, il peut y avoir des différences dans la façon dont il est régulé ou exprimé dans les grenouilles. Cela peut nécessiter des ajustements au vecteur ou à d'autres conditions expérimentales.
* Régulation des gènes: Le scientifique devra considérer les éléments réglementaires qui contrôlent l'expression du gène dans la grenouille. Ceux-ci peuvent différer de l'espèce d'origine.
* Préoccupations éthiques: La recherche impliquant des modèles animaux nécessite un examen attentif des implications éthiques.
Faites-moi savoir si vous souhaitez que je développe une étape ou un aspect particulier!
