Le clonage fonctionnel, également connu sous le nom de clonage de position, vise à isoler un gène en fonction de son phénotype et de son emplacement chromosomique. Voici les étapes clés impliquées:
1. Identifiez un phénotype d'intérêt:
- Commencez par une compréhension claire du phénotype que vous souhaitez cloner. Il pourrait s'agir d'une maladie, d'un trait de développement ou de toute autre caractéristique observable.
2. Carte le gène à une région chromosomique spécifique:
- Analyse de liaison: Analyser les modèles de ségrégation du phénotype avec des marqueurs génétiques connus (comme les SNP ou les microsatellites) dans une famille ou une population. Identifiez les marqueurs qui co-séparent avec le phénotype, ce qui suggère qu'ils sont proches du gène d'intérêt.
- Études d'association: Corréler le phénotype avec des variantes génétiques spécifiques (SNP) dans une approche basée sur la population. Cela aide à identifier les régions du génome associées au phénotype.
- Délétions / duplications du chromosome: Examiner les individus avec des réarrangements chromosomiques. Si le phénotype est affecté par une suppression ou une duplication dans une région spécifique, il suggère que le gène responsable se trouve dans cette région.
3. Répartir la région candidate:
- Mappage fin: Utilisez des marqueurs génétiques à haute densité et des familles / populations supplémentaires pour affiner l'emplacement du gène dans la région précédemment identifiée.
- Mappage physique: Utilisez des méthodes physiques comme la marche du chromosome et le saut de chromosomes pour établir une carte physique de la région, en identifiant les clones qui se chevauchent.
- Identification des gènes candidats: Identifiez tous les gènes présents dans la région rétrécie en utilisant des bases de données génomiques disponibles.
4. Cloner et analyser les gènes candidats:
- Clonage des gènes: Isoler et séquence des fragments d'ADN contenant les gènes candidats en utilisant des techniques telles que la PCR ou le dépistage de la bibliothèque.
- Analyse d'expression: Examinez le modèle d'expression des gènes candidats dans les tissus pertinents pour le phénotype.
- Études fonctionnelles: Mener des tests fonctionnels (comme des études in vitro ou in vivo) pour déterminer le rôle des gènes candidats dans le phénotype. Cela peut impliquer:
- surexpression ou knockdown du gène
- étudier les effets des mutations dans le gène
- Étude des interactions protéiques du produit génique
5. Validation et confirmation:
- Études indépendantes: Reproduire les résultats dans différentes populations ou modèles expérimentaux.
- Modèles animaux: Créez des modèles animaux avec des mutations dans le gène identifié pour confirmer son rôle dans le phénotype.
- potentiel thérapeutique: Évaluez le gène et ses produits pour des applications thérapeutiques potentielles.
Remarque importante:
- Le clonage fonctionnel est souvent un processus complexe et long.
- Il nécessite une analyse génétique approfondie, des techniques de biologie moléculaire et une expertise biologique.
- Le succès du clonage fonctionnel dépend de la disponibilité de ressources génétiques appropriées, de la complexité du phénotype et de l'architecture génétique du trait.
Alternatives au clonage fonctionnel:
- Séquençage de nouvelle génération: Permet le séquençage du génome entier ou de l'exome, facilitant l'identification des gènes associés à des phénotypes spécifiques.
- Études d'association à l'échelle du génome (GWAS): Fournir un outil puissant pour détecter les variantes génétiques associées à des traits complexes, bien qu'ils ne puissent pas identifier directement les gènes causaux.
- Génétique inversée: Commencez par un gène et étudiez sa fonction à l'aide d'outils d'édition de gènes comme CRISPR-CAS9.
Le clonage fonctionnel a joué un rôle crucial dans la compréhension de la base génétique de diverses maladies et traits, contribuant de manière significative à l'avancement de la médecine et de la biologie. Cependant, avec l'avènement des nouvelles technologies, les approches alternatives deviennent de plus en plus importantes dans la recherche génétique.
