Une nouvelle variante du système d'édition de gènes CRISPR-Cas9 facilite la réingénierie de quantités massives de cellules pour des applications thérapeutiques. L'approche, développée aux Gladstone Institutes et à l'UC San Francisco (UCSF), permet aux scientifiques d'introduire des séquences d'ADN particulièrement longues à des emplacements précis dans les génomes des cellules à des efficacités remarquablement élevées sans les systèmes de délivrance virale traditionnellement utilisés pour transporter l'ADN dans les cellules.

"L'un de nos objectifs depuis de nombreuses années a été de mettre de longues instructions d'ADN dans un site ciblé du génome d'une manière qui ne dépend pas des vecteurs viraux", déclare Alex Marson, MD, Ph.D., directeur du Gladstone -Institut d'immunologie génomique de l'UCSF et auteur principal de la nouvelle étude. "C'est un grand pas vers la prochaine génération de thérapies cellulaires sûres et efficaces."

Dans le nouvel article publié dans la revue Nature Biotechnology , Marson et ses collègues décrivent non seulement la technologie, mais montrent comment elle peut être utilisée pour générer des cellules CAR-T ayant le potentiel de lutter contre le myélome multiple, un cancer du sang, ainsi que pour réécrire des séquences de gènes où des mutations peuvent conduire à des maladies immunitaires héréditaires rares. maladies.

"Nous avons montré que nous pouvions concevoir plus d'un milliard de cellules en une seule analyse, ce qui est bien supérieur au nombre de cellules dont nous avons besoin pour traiter un patient individuel", déclare le premier auteur Brian Shy, MD, Ph.D., chercheur clinique dans le laboratoire de Marson.

De l'ADN double brin à l'ADN simple brin

CRISPR-Cas9, un système qui modifie les gènes à l'intérieur des cellules vivantes, a été utilisé comme outil de recherche fondamentale au cours de la dernière décennie. De plus en plus, de nombreux cliniciens-chercheurs sont enthousiasmés par le potentiel de CRISPR-Cas9 pour générer des thérapies cellulaires vivantes.

Avec l'édition de gènes, on peut désactiver, supprimer ou remplacer un gène muté causant une maladie, ou stimuler l'activité de lutte contre le cancer d'une cellule immunitaire, entre autres. Alors que les premières applications thérapeutiques de CRISPR-Cas9 sont récemment entrées dans les essais cliniques, la technologie est encore limitée par le défi de fabriquer en toute sécurité de grandes quantités de cellules correctement éditées.

Traditionnellement, les chercheurs se sont appuyés sur des vecteurs viraux - les coquilles de virus sans leurs composants pathogènes - pour transporter l'ADN (appelé la matrice d'ADN) utilisé pour la thérapie génique dans les cellules. Cependant, la fabrication de grandes quantités de vecteurs viraux de qualité clinique a été un goulot d'étranglement majeur dans la fourniture de thérapies cellulaires aux patients. De plus, les chercheurs ne peuvent pas facilement contrôler où les vecteurs viraux traditionnels insèrent les gènes dans le génome.

"L'utilisation de vecteurs viraux coûte cher et nécessite beaucoup de ressources", déclare Shy. "L'un des principaux avantages d'une approche non virale du génie génétique est que nous ne sommes pas aussi limités par les coûts, la complexité de la fabrication et les défis de la chaîne d'approvisionnement."

En 2015, le groupe de Marson, en collaboration avec le laboratoire de la pionnière du CRISPR, Jennifer Doudna, Ph.D., a montré pour la première fois qu'ils pouvaient insérer de courts modèles d'ADN dans des cellules immunitaires sans vecteurs viraux, en utilisant un champ électrique qui rend les membranes externes des cellules plus perméables. . En 2018, ils ont développé une méthode pour couper et coller des séquences d'ADN plus longues dans des cellules immunitaires avec CRISPR et l'ont publiée dans Nature .

Puis, en 2019, les chercheurs ont découvert qu'en utilisant également une version modifiée des matrices d'ADN pouvant se lier à l'enzyme Cas9 - la même protéine qui agit comme des ciseaux moléculaires lors de l'édition de gènes CRISPR - ils pouvaient fournir les nouvelles séquences au génome ciblé. site plus efficacement. Ce travail a été publié dans Nature Biotechnology .

Cependant, des travaux supplémentaires étaient nécessaires pour améliorer le rendement des cellules immunitaires conçues avec succès et pour rendre le processus compatible avec la fabrication de futures thérapies cellulaires. Ces objectifs ont motivé l'étude actuelle de l'équipe.

L'ADN peut exister en brins simples ou doubles (comme des morceaux opposés de Velcro), et Cas9 se fixe à l'ADN double brin. Les chercheurs ont rapidement découvert que des niveaux élevés de matrice d'ADN double brin peuvent être toxiques pour les cellules, de sorte que la méthode ne pouvait être utilisée qu'avec de faibles quantités d'ADN matrice, ce qui entraînait une faible efficacité.

L'équipe savait que l'ADN simple brin était moins toxique pour les cellules, même à des concentrations relativement élevées. Ainsi, dans le nouvel article, ils décrivent une méthode pour attacher l'enzyme Cas9 modifiée à un ADN modèle simple brin, en ajoutant juste un petit surplomb d'ADN double brin aux extrémités.

"Cela nous donne une approche équilibrée, le meilleur des deux mondes", déclare Marson.

L'ADN modèle simple brin pourrait plus que doubler l'efficacité de l'édition de gènes par rapport à l'ancienne approche double brin. Et les extrémités double brin des molécules permettent aux chercheurs d'utiliser Cas9 pour améliorer la livraison de vecteurs non viraux dans les cellules.

"Cette technologie a le potentiel de rendre les nouvelles thérapies cellulaires et géniques plus rapides, meilleures et moins chères", déclare Jonathan Esensten, MD, Ph.D., auteur du nouveau travail et professeur adjoint de médecine de laboratoire à l'UCSF et un enquêteur affilié chez Gladstone.

Un chemin vers la clinique

Dans l'étude, les chercheurs ont utilisé la nouvelle matrice d'ADN pour générer plus d'un milliard de cellules CAR-T ciblant le myélome multiple. Les cellules CAR-T sont des cellules T immunitaires génétiquement modifiées pour lutter efficacement contre des cellules ou des cancers spécifiques. Avec les nouvelles matrices monocaténaires dirigées par Cas9, environ la moitié de toutes les cellules T ont acquis le nouveau gène et, par conséquent, ont été converties en cellules CAR-T.

"Nous savions que le ciblage des matrices d'ADN vers un emplacement spécifique du génome, appelé le site TRAC, améliorerait la puissance anti-tumorale des cellules CAR-T", déclare Justin Eyquem, Ph.D., co-auteur de l'étude nouvel article, professeur adjoint de médecine à la division d'hématologie et d'oncologie de l'UCSF et chercheur affilié à Gladstone. "Cette nouvelle approche non virale nous permet d'atteindre ce ciblage beaucoup plus efficacement, ce qui accélérera le développement de la prochaine génération de thérapies cellulaires CAR-T."

De plus, les chercheurs ont montré que leur approche pouvait, pour la première fois, remplacer dans leur intégralité deux gènes associés à des maladies immunitaires génétiques rares, les gènes IL2RA et CTLA4.

Dans le passé, les scientifiques avaient montré qu'ils pouvaient remplacer de petites sections du gène IL2RA lorsque certains patients présentaient des mutations. Maintenant, l'équipe de Marson a prouvé qu'elle pouvait remplacer l'ensemble des gènes IL2RA et CTLA4 en une seule fois, une approche "taille unique" qui pourrait traiter de nombreux patients avec différentes mutations de ces gènes, plutôt que d'avoir à générer des modèles personnalisés pour la mutation de chaque patient. Près de 90 % des cellules traitées avec cette approche de génie génétique ont obtenu les versions saines des gènes.

Les chercheurs demandent maintenant l'autorisation de faire avancer les essais cliniques utilisant la technologie CRISPR non virale à la fois dans la thérapie cellulaire CAR-T et dans le traitement du déficit en IL2RA. + Explorer plus loin

L'étude encourage une approche prudente des thérapies CRISPR