Le clonage moléculaire est une méthode de biotechnologie commune à laquelle tous les étudiants et chercheurs devraient se familiariser. Clonage moléculaire en utilisant un type d'enzyme appelé une enzyme de restriction pour couper l'ADN humain en fragments qui peuvent ensuite être insérés dans l'ADN plasmidique d'une cellule bactérienne. Les enzymes de restriction coupent l'ADN double brin en deux. Selon l'enzyme de restriction, la coupe peut entraîner une extrémité collante ou une extrémité émoussée. Les extrémités collantes sont plus utiles dans le clonage moléculaire car elles garantissent que le fragment d'ADN humain est inséré dans le bon sens dans le plasmide. Le processus de ligature, ou la fusion de fragments d'ADN, nécessite moins d'ADN lorsque l'ADN a des extrémités collantes. Enfin, plusieurs enzymes de restriction terminales collantes peuvent produire la même extrémité collante, même si chaque enzyme reconnaît une séquence de restriction différente. Cela augmente la probabilité que votre région d'ADN d'intérêt peut être coupé par des enzymes de la fin collantes.
enzymes de restriction et sites de restriction
Les enzymes de restriction sont des enzymes qui reconnaissent des séquences spécifiques sur ADN double brin et couper l'ADN en deux à cette séquence. La séquence reconnue est appelée le site de restriction. Les enzymes de restriction sont appelées endonucléases parce qu'elles coupent l'ADN double brin, qui est l'ADN normalement existant, aux endroits qui se trouvent entre les extrémités de l'ADN. Il y a plus de 90 enzymes de restriction différentes. Chacun reconnaît un site de restriction distinct. Les enzymes de restriction clivent leurs sites de restriction respectifs 5 000 fois plus efficacement que d'autres sites qu'ils ne reconnaissent pas.
La bonne orientation
Les enzymes de restriction se divisent en deux classes générales. Ils coupent l'ADN en extrémités collantes ou extrémités émoussées. Une extrémité collante a une courte région de nucléotides, les éléments constitutifs de l'ADN, qui est non appariée. Cette région non appariée s'appelle un surplomb. Le porte-à-faux est dit collant parce qu'il veut et va se coupler avec une autre extrémité collante qui a une séquence de surplomb complémentaire. Les extrémités collantes sont comme des jumeaux perdus depuis longtemps qui cherchent à se serrer dans leurs bras une fois qu'ils se rencontrent. D'autre part, les extrémités émoussées ne sont pas collantes car tous les nucléotides sont déjà appariés entre les deux brins d'ADN. L'avantage des extrémités collantes est qu'un fragment d'ADN humain ne peut s'insérer que dans un plasmide bactérien dans une direction. En revanche, si l'ADN humain et le plasmide bactérien ont des extrémités émoussées, l'ADN humain peut être inséré tête-à-queue ou queue-à-tête dans le plasmide.
Ligating Sticky Ends nécessite moins d'ADN
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Bien que l'ADN avec les extrémités des bâtonnets ait plus de facilité à se trouver les uns les autres en raison de leur «adhérence», ni les extrémités collantes ni les extrémités émoussées ne peuvent fusionner en un morceau d'ADN continu. La formation d'un morceau continu d'ADN complètement lié nécessite une enzyme appelée ligase. Les ligases relient les épines dorsales des nucléotides aux extrémités collantes ou émoussées, résultant en une chaîne continue de nucléotides. Parce que les extrémités collantes se trouvent plus rapidement en raison de leur attraction les unes pour les autres, le processus de ligature nécessite moins d'ADN humain et moins d'ADN plasmidique. Les extrémités émoussées de l'ADN et des plasmides sont moins susceptibles de se trouver, et donc la ligature des extrémités émoussées nécessite que plus d'ADN est mis dans le tube à essai.
Différentes enzymes peuvent donner la même extrémité collante
Les sites de restriction sont situés dans tout le génome des organismes, mais ne sont pas espacés régulièrement. Dans les plasmides, ils peuvent être conçus pour être situés l'un à côté de l'autre. Les scientifiques qui veulent découper un fragment d'ADN humain du génome humain doivent trouver des sites de restriction qui se trouvent devant et derrière la région du fragment. En plus de garantir qu'un fragment d'ADN est inséré dans la bonne direction, différentes enzymes terminales collantes peuvent créer la même extrémité collante même si elles reconnaissent différentes séquences de restriction. Par exemple, BamHI, BglII et Sau3A ont différentes séquences de reconnaissance mais produisent la même extrémité collante GATC. Cela augmente la probabilité qu'il y aura des sites de restriction collants qui flanquent votre gène d'intérêt humain.
