Avant de pouvoir séquencer l'ADN ou le modifier par génie génétique, les scientifiques doivent d'abord l'isoler. Cela peut sembler une tâche difficile, car les cellules contiennent une grande variété d'autres composés comme les protéines, les graisses, les sucres et les petites molécules. Heureusement, les biologistes peuvent utiliser les propriétés chimiques de l'ADN pour séparer l'ADN de ces contaminants et le préparer pour une étude plus approfondie. Ce processus s'appelle l'extraction de l'ADN.

La lyse cellulaire

Il existe de nombreuses techniques différentes pour l'extraction de l'ADN. Celui utilisé par un laboratoire individuel dépend du type d'expérience à effectuer et de la pureté de l'ADN. Les scientifiques commencent généralement avec un échantillon contenant des cellules - un échantillon de tissu ou de sang, par exemple - et brisent les cellules ouvertes, ou les lysent. Il existe plusieurs façons de lyser les cellules. L'ajout d'un détergent entraînera leur séparation, tout comme le fait de les soumettre à des ondes sonores à haute fréquence. Alternativement, mélanger l'échantillon avec des billes de verre et le faire vibrer rapidement cassera physiquement les cellules et libérer leur contenu.

Approches rapides et sales

Si une pureté élevée n'est pas requise, les scientifiques peuvent ajouter enzyme appelée protéinase K pour décomposer la plupart des protéines dans l'échantillon, puis l'utiliser tel quel. Cependant, cette technique est très sale, car la plupart des contaminants sont toujours présents, de sorte que ce n'est approprié que si la vitesse est une priorité et la pureté n'est pas un problème. Une autre approche rapide et sale consiste à éliminer les protéines en augmentant la concentration en sel en ajoutant des sels comme l'acétate d'ammonium ou de potassium pour forcer la précipitation des protéines. Cette technique est également assez sale car de nombreux autres contaminants sont toujours présents.

Extraction au phénol-chloroforme

Une autre approche consiste à lyser les cellules avec un détergent puis à mélanger la solution avec de l'alcool isoamylique, du chloroforme et du phénol . La solution se sépare ensuite en deux couches. Les protéines se retrouvent dans la couche organique supérieure, tandis que l'ADN reste dans la couche aqueuse inférieure. Cette technique nécessite un contrôle minutieux de la concentration en sel et du pH pour de bons résultats. Cela prend du temps, et le phénol et le chloroforme sont des produits chimiques hautement toxiques. Par conséquent, alors que les extractions phénol-chloroforme étaient autrefois courantes, d'autres techniques sont devenues plus populaires ces dernières années. La chromatographie d'échange d'anions offre une plus grande pureté et des résultats plus cohérents que le phénol extraction au chloroforme. Un tube ou une colonne est emballé avec de petites particules qui ont des sites chargés positivement sur eux où une molécule chargée négativement ou un anion peut se lier. L'ADN se lie à ces sites d'échange d'anions tandis que d'autres contaminants comme les protéines et l'ARN sont lavés de la colonne. Plus tard, une solution riche en sel est utilisée pour extraire l'ADN de la colonne.

Kits

La technique la plus rapide et peut-être la plus fiable pour purifier l'ADN est l'utilisation d'un kit spécialement fabriqué. Ces kits contiennent des membranes de gel de silice dans un tube. L'ADN adhère à la membrane tandis que d'autres contaminants sont éliminés en utilisant une série de solutions de sel spécialement préparées qui accompagnent le kit. Enfin, l'ADN est lavé de la colonne avec une solution à faible teneur en sel. Ces kits sont rapides, faciles à utiliser et offrent des résultats reproductibles.

Absorbance

Une fois l'ADN isolé et remis en suspension dans une solution tampon à pH contrôlé, la dernière étape consiste à tester sa pureté . Un moyen facile et pratique de le faire consiste à vérifier la quantité de lumière ultraviolette absorbée aux longueurs d'onde de 260 et 280 nanomètres. L'absorption à 260 nanomètres divisée par l'absorption à 280 nanomètres devrait être égale à 1,8 si l'ADN est pur. La mesure de l'absorbance à 260 nanomètres vous permet également de déterminer la concentration de l'ADN.