ADN recombinant (l'acide désoxyribonucléique est un type synthétique d'acide nucléique créé en liant des séquences d'ADN qui n'existeraient pas naturellement dans des conditions normales et des conditions environnementales. Une procédure avancée en biologie et en génétique connue sous le nom de clonage de gènes.L'ADN recombinant est mis dans une cellule, qui produit alors une protéine complètement nouvelle, et est utilisé pour synthétiser des médicaments, des anticorps ou des protéines spécifiques pour la recherche.

Introduction

L'ADN d'un organisme donneur ou d'une source biologique est d'abord extrait des cellules et ensuite soumis à un processus de coupe connu sous le nom de restriction enzymatique, ce qui génère des fragments d'ADN contenant le ou les gènes d'intérêt. "clonés" (c'est-à-dire insérés) ou collés sur des fragments de l'organisme receveur, puis insérés dans de plus grandes molécules d'ADN ("plasmides"), qui sont placées dans une bactérie et multiplier. L'ADN recombinant est ensuite récupéré et vérifié.

Isolement de l'ADN

L'ADN doit d'abord être extrait et purifié à partir d'autres molécules cellulaires, telles que les acides ribonucléiques (ARN), les protéines et les structures cellulaires membranes. A des fins de clonage, l'ADN est obtenu à partir du noyau et est connu comme "ADN génomique". Une méthode courante pour l'extraction de l'ADN est l'ultracentrifugation des composants cellulaires dans un gradient de densité constitué de bromure d'éthidium dans le chlorure de césium. Alternativement, une série de lavages tampons alcalins et salins peuvent également être utilisés pour récupérer l'ADN .. Une fois que cela est précipité et nettoyé de tous les autres contaminants indésirables, l'ADN peut être coupé en fragments.

Restriction Enzyme Digestion de l'ADN

Les enzymes de restriction sont des enzymes qui découpent des séquences d'ADN très spécifiques; ils sont utilisés pour créer des fragments d'ADN uniques. Ce processus garantit qu'aucune séquence inexacte, incorrecte ou indésirable n'est générée et n'est incorporée accidentellement dans l'ADN recombinant final, ce qui peut entraîner à la fois un échec expérimental et une mort cellulaire. Pour générer les fragments d'ADN désirés, une enzyme spécifique (ou une combinaison d'enzymes) est utilisée pour découper ou digérer l'ADN. Les fragments sont ensuite purifiés par électrophorèse sur gel, ce qui les sépare de l'ADN indésirable. Une méthode plus grossière implique simplement un cisaillement mécanique, qui déchire les segments d'ADN plus longs en plus petits qui peuvent être utilisés pour le clonage.

Ligation de l'ADN

La ligature est le processus consistant à coller ou à joindre le donneur et des fragments d'ADN récepteur (ou vecteur) pour créer une molécule d'ADN recombinant. Idéalement, les enzymes de restriction choisies pour créer les fragments auraient été soigneusement étudiées et conçues de manière à ce qu'elles permettent d'assembler ces morceaux comme un puzzle. Pour ce faire, les enzymes de restriction qui produisent des «extrémités cohésives» compatibles sont préférées, de sorte que tous les fragments compatibles se lient naturellement les uns aux autres; sinon, l'enzyme ADN ligase peut être utilisée pour joindre les segments d'ADN avec des liaisons phosphodiester.

Réplication d'ADN recombinant

Le processus de transformation ou de choc thermique est utilisé pour mettre la molécule d'ADN recombinant dans un cellule bactérienne hôte, qui peut ensuite générer de nombreuses copies de l'ADN synthétique. Ces bactéries sont cultivées sur des plaques d'agar, cultivées dans des bouillons bactériens spéciaux, puis lysées afin de libérer l'ADN recombinant. Enfin, l'ADN peut être vérifié par séquençage d'ADN, expériences fonctionnelles et digestion par des enzymes de restriction.