Une cellule de fibroblaste de souris imagée sur une métasurface constituée de nanoparticules d'or sous un microscope à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) présente une émission accrue et confinée de la protéine paxilline électroluminescente au niveau des adhérences focales près de la membrane. Des chercheurs de l'Université de Kyushu ont montré que de telles métasurfaces peuvent être utilisées avec des microscopes à fluorescence conventionnels comme voie simple pour améliorer la résolution jusqu'à près de la limite de diffraction. L'utilisation des conditions TIRF aide à réduire les émissions parasites du plus profond de la cellule pour améliorer encore le contraste des structures près de la métasurface. Crédit :Kaoru Tamada, Université de Kyushu
Dans la quête d'imager des structures et des phénomènes extrêmement petits avec une plus grande précision, les scientifiques ont repoussé les limites de la résolution des microscopes optiques, mais ces progrès s'accompagnent souvent d'une complication et d'un coût accrus.
Maintenant, des chercheurs au Japon ont montré qu'une surface de verre incrustée de nanoparticules d'or auto-assemblées peut améliorer la résolution avec peu de coûts supplémentaires, même en utilisant un microscope conventionnel à grand champ, facilitant la microscopie de fluorescence à haute résolution capable d'imagerie à grande vitesse de cellules vivantes.
Parce que les microscopes optiques amplifient la lumière pour obtenir des images détaillées d'une structure, la taille des objets que l'on peut distinguer a longtemps été limitée par la diffraction, une propriété de la lumière qui la fait se propager lorsqu'elle traverse une ouverture.
Les chercheurs ont développé des techniques pour surmonter ces limites avec des systèmes optiques très avancés, mais beaucoup d'entre eux dépendent de l'utilisation de lasers puissants, qui peuvent endommager voire tuer des cellules vivantes, et numérisation de l'échantillon ou traitement de plusieurs images, qui inhibe l'imagerie en temps réel.
"Les techniques récentes peuvent produire des images époustouflantes, mais beaucoup d'entre eux nécessitent un équipement hautement spécialisé et sont incapables d'observer le mouvement des cellules vivantes, " dit Kaoru Tamada, professeur distingué à l'Institut de chimie et d'ingénierie des matériaux de l'Université de Kyushu.
Imagerie des cellules par des méthodes de microscopie à fluorescence en temps réel, Tamada et son groupe ont découvert qu'ils pouvaient améliorer la résolution sous un microscope conventionnel à grand champ jusqu'à près de la limite de diffraction simplement en changeant la surface sous les cellules.
En microscopie à fluorescence, les structures cellulaires d'intérêt sont marquées avec des molécules qui absorbent l'énergie de la lumière entrante et, par le processus de fluorescence, la réémettre sous forme de lumière d'une couleur différente, qui est collecté pour former l'image.
Bien que les cellules soient généralement imagées sur du verre ordinaire, Le groupe de Tamada a recouvert la surface du verre d'une couche auto-assemblée de nanoparticules d'or recouverte d'une fine couche de dioxyde de silicium, créant une métasurface avec des propriétés optiques spéciales.
Seulement 12 nm de diamètre, les nanoparticules métalliques organisées présentent un phénomène connu sous le nom de résonance plasmonique de surface localisée, qui permet à la métasurface de collecter l'énergie des molécules émettant de la lumière à proximité pour une réémission très efficace, produisant ainsi une émission améliorée confinée à la surface des nanoparticules de 10 nm d'épaisseur.
Une cellule de fibroblaste de souris imagée sur une métasurface constituée de nanoparticules d'or sous une microscopie à fluorescence à grand champ présente une émission accrue et confinée de la protéine paxilline électroluminescente au niveau des adhérences focales près de la membrane. Des chercheurs de l'Université de Kyushu ont montré que de telles métasurfaces peuvent être utilisées avec des microscopes à fluorescence conventionnels comme voie simple pour améliorer la résolution jusqu'à près de la limite de diffraction. L'éclairage de l'échantillon perpendiculairement à la métasurface permet au corps cellulaire d'être grossièrement considéré comme une émission faible tout en imageant la paxilline sous forme de points lumineux. Crédit :Kaoru Tamada, Université de Kyushu
« En introduisant les nanoparticules, nous avons effectivement créé un plan électroluminescent qui n'a que quelques nanomètres d'épaisseur, " explique Tamada. " Parce que la lumière d'intérêt est émise par une couche si mince, nous pouvons mieux nous concentrer dessus."
Des avantages supplémentaires découlent de la rapidité du transfert d'énergie vers la métasurface, localiser davantage les points d'émission en réduisant la diffusion, et l'indice de réfraction élevé de la métasurface, ce qui permet d'améliorer la résolution selon la limite de diffraction d'Abbe.
En utilisant la métasurface, les chercheurs ont imagé en temps réel des cellules de souris connues sous le nom de fibroblastes 3T3 qui ont été génétiquement modifiées pour produire une protéine appelée paxilline qui est modifiée pour émettre de la lumière verte lorsqu'elle est excitée. La paxilline joue un rôle clé dans la création d'adhérences focales, des points où les molécules de la membrane cellulaire interagissent avec le monde extérieur.
Illuminer l'ensemble de l'échantillon avec une lumière laser perpendiculaire à la surface, les chercheurs ont pu imager les changements de paxilline près de la membrane cellulaire avec une résolution plus élevée en utilisant la métasurface au lieu du verre.
Inclinaison de la lumière d'éclairage pour obtenir une réflexion interne totale, les chercheurs ont pu obtenir des images avec un contraste encore plus élevé car la majeure partie de la lumière d'éclairage est réfléchie par la surface avec seulement une petite quantité atteignant le côté de la cellule, réduisant ainsi les émissions parasites produites par l'éclairage pénétrant profondément dans la cellule.
L'analyse des images enregistrées toutes les 500 millisecondes avec un appareil photo numérique super-résolution a révélé de nettes différences d'intensité sur des spots ne couvrant que quelques pixels, indiquant que la résolution était d'environ 200 nm, proche de la limite de diffraction.
Les cellules pouvaient également être imagées plus longtemps sur la métasurface car l'émission était améliorée malgré une énergie d'entrée plus faible, réduisant ainsi les dommages cellulaires au fil du temps.
« Les métasurfaces sont une option prometteuse pour améliorer la résolution pour les chercheurs du monde entier utilisant les microscopes optiques conventionnels dont ils disposent déjà, " commente Tamada.
En plus de continuer à améliorer les surfaces utilisables avec les microscopes conventionnels, les chercheurs explorent également les avantages qu'ils peuvent avoir pour des systèmes de microscope plus sophistiqués.
