L'ADN exogène spécifique dérivé de la capside T4 plus l'encapsidation des protéines et le schéma d'administration des cellules eucaryotes. (A) L'ADN codant pour un peptide CTS N-terminal de 10 acides aminés fusionné au phage P1 Cre permet la synthèse de CTS-Cre et le ciblage de l'enzyme dans le noyau-échafaudage précoce de la procapside T4 in vivo. L'assemblage de la procapside et la protéase virale spécifique à la maturation stabilisent la procapside, retirer la majeure partie du noyau d'échafaudage sous forme de peptides, et retirer le peptide CTS de Cre. Des mutations dans la terminase virale bloquent l'encapsidation de l'ADN et permettent à une grande procapside contenant Cre mature mais vide d'ADN d'être hautement purifiée à partir de bactéries infectées par le virus. (B) Emballage in vitro dans la capside mature de l'ADN plasmidique contenant mCherry entraîné par un promoteur CMV et deux sites loxP flanquant un site d'enzyme de restriction SfiI qui permettent la linéarisation requise pour l'emballage. L'ADN est emballé dans la procapside par la protéine motrice de la terminase entraînée par l'ATP (gp17) avec une efficacité élevée. (C) L'enzyme Cre emballé recircularise l'ADN plasmidique linéaire emballé entre les deux sites loxP. La capside contenant l'ADN est absorbée par les cellules eucaryotes, ici sans afficher une cible peptidique spécifique, ou dans des cellules eucaryotes en utilisant spécifiquement des peptides présentés par Soc et Hoc qui ont une forte affinité pour les récepteurs RP1 et RP2, respectivement. Crédit :Liu JL, et al. (Publié en ligne avant impression le 26 août 2014) Enzyme virale encapsidée par des nanoparticules et ADN restructuré pour l'administration cellulaire et l'expression génique. Crédit :Liu JL, et al. (2014) Enzyme virale encapsidée par des nanoparticules et ADN restructuré pour l'administration cellulaire et l'expression génique. Proc Natl Acad Sci USA Publié en ligne avant impression le 26 août 2014. doi:10.1073/pnas.1321940111
(Phys.org) -En chargeant une protéine et un acide nucléique spécifiques dans une nanoparticule à base de capside de phage T4 icosaédrique, les ligands du véhicule de délivrance cellulaire résultant peuvent se lier à la surface de tissus cibles spécifiques pour délivrer la cargaison de protéine/ADN. (Les nanoparticules virales icosaédriques sont des enveloppes protéiques évolutives assemblées dans un ordre hiérarchique qui se traduit par une couche protéique stable et un espace interne pour accueillir les acides nucléiques et les protéines ; une capside est l'enveloppe protéique d'un virus.) La technique a un médicament et un gène- applications de livraison dans les maladies humaines, imagerie diagnostique et cellulaire, et d'autres domaines médicaux. Récemment, scientifiques du US Naval Research Laboratory, Washington, DC et l'Université du Maryland à Baltimore ont conditionné des nanoparticules T4 in vivo avec recombinaison cyclique active, ou Cre, recombinase (une enzyme de recombinaison génétique utilisée pour manipuler la structure du génome et contrôler l'expression des gènes) et in vitro avec mCherry fluorescent (une protéine fluorescente utilisée comme marqueur lorsqu'elle est marquée sur des molécules et des composants cellulaires) d'expression d'ADN plasmidique, et a livré ces nanoparticules dans les cellules cancéreuses :lorsqu'elles sont libérées dans les cellules en présence à la fois d'ADN et de protéines, la recombinase améliore l'expression de mCherry par circularisation (c'est-à-dire changer l'ADN linéaire emballé en une boucle circulaire). Les chercheurs affirment que cet emballage efficace et spécifique dans les capsides et le déballage à la fois de l'ADN et des protéines avec libération des complexes protéine/ADN altérés par voie enzymatique des nanoparticules dans les cellules ont un potentiel dans de nombreuses applications en aval telles que la génétique et la thérapie contre le cancer.
Le Dr Jinny L. Liu a discuté du document qu'elle, Prof. Lindsay W. Black et leurs co-auteurs publiés dans Actes de la National Academy of Sciences USA . "Les nanoparticules virales icosaédriques sont essentiellement des nanoconteneurs de 100 nm sur 80 nm qui permettent de conditionner le matériel génétique exogène in vitro grâce à une machinerie d'acide nucléique qui permet généralement uniquement à l'ADN/ARN linéaire d'être emballé à travers un canal porte, " Liu raconte Phys.org . "Toutefois, in vitro l'emballage des protéines est généralement impossible, car pour la plupart des nanoparticules virales, il n'existe pas de machine d'emballage de protéines comparable à une machine d'emballage d'acide nucléique. » Bien que la protéine puisse être chimiquement réticulée à la surface interne de la capside, on s'attend à ce que cela conduise à la dénaturation des protéines et à la perte d'activité enzymatique.
Cela étant dit, la nature a développé des solutions à cette énigme de l'emballage des protéines. Pendant in vivo assemblage de capside virale, Liu explique, certains virus bactériens, ou bactériophages, protéines cibles dans les procapsides avant l'acide nucléique est conditionné de manière à éjecter les protéines avec l'acide nucléique, facilitant ainsi l'infection conjointement avec l'acide nucléique. (Un procapside, ou prohead, est une structure de capside virale immature formée aux premiers stades de l'auto-assemblage de certains bactériophages. La production et l'assemblage de proheads stables est un précurseur essentiel de l'empaquetage du génome des bactériophages.) Seuls quelques phages ont bien caractérisé in vivo systèmes d'emballage de protéines, et le phage T4 est le mieux caractérisé. "Le laboratoire du professeur Black à l'UMB et mon laboratoire au NRL ont démontré que non seulement une enzyme étrangère spécifique - recombinase cyclique (Cre) recombinase - peut être emballée dans la capside in vivo , mais aussi qu'il est actif au sein de la capside. » Cette activité a été démontrée en montrant la religation (la réunion de deux brins d'ADN ou d'autres molécules par une liaison ester phosphate) d'ADN linéaire emballé flanqué de deux sites de recombinaison Cre.
L'article montre que l'espace substantiel dans un nanoconteneur T4 accueille l'enzyme Cre active ainsi que l'ADN exogène. "Pour les applications potentielles, T4 peut emballer jusqu'à 50 kb d'ADN linéaire exogène contenant les gènes souhaités de pleine longueur ainsi que des recombinases, soit des protéines Cre ou -red, pour une recombinaison homologue spécifique au sein du chromosome, " note Liu. ( Recombinaison homologue est un type de recombinaison génétique dans laquelle des séquences nucléotidiques sont échangées entre deux molécules d'ADN similaires ou identiques.) "Nous nous attendons à ce que l'enzyme cas9 puisse être encapsidée de manière comparable - et en fait, au moins huit protéines différentes ont été encapsidées de cette manière. Par recombinaison homologue, notre système peut permettre au gène corrigé de remplacer le gène muté à son emplacement d'origine dans le chromosome ou en éliminant précisément les gènes hyperactifs dans les cellules souches." Liu souligne que le vecteur de livraison T4 est plus sûr et mieux contrôlé que les autres gènes de livraison virale thérapie, tels que ceux délivrant des gènes en utilisant des vecteurs viraux animaux infectieux pour insérer au hasard le gène dans le chromosome.
Dans leur papier, les auteurs rapportent que l'expression du gène de la capside T4 et le système de délivrance de protéines peuvent être complémentaires ou utilisés en conjonction avec la thérapie génique basée sur l'ARN Cas et la taran nucléase. (Les gènes Cas codent pour des protéines liées aux loci d'ADN contenant de courtes répétitions de séquences de bases connues sous le nom de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster, ou CRISPRs.) "Le système d'expression des nanoparticules T4 peut facilement compléter la recombinaison à base de Cas9 et de taran nucléase en empaquetant le cas9 linéaire, ADN plasmidique cible-sgRNA, et Cre recombinase – ou encore ligase, une enzyme qui facilite la jonction des brins d'ADN - et délivre les nanoparticules T4 résultantes dans les cellules eucaryotes receveuses avec une spécificité élevée en utilisant SOC et HOC, " Liu raconte Phys.org . (SOC et HOC sont des protéines de capside T4 dispensables.) "En affichant les ligands de ciblage (molécules de liaison) sur la surface, l'expression du gène de la capside T4 et le système protéique seront capables de délivrer efficacement les plasmides Cas9 et sgRNA ensemble dans les cellules receveuses souhaitées. Protéines pertinentes enzymatiquement actives Cas9, exonucléase lambda, la protéine bêta lambda et d'autres peuvent être délivrées directement en même temps à partir de la nanoparticule T4."
Mesure de l'inhibition par les inhibiteurs de l'endocytose et colocalisation avec les lysosomes dans les cellules A549 traitées par A546-T4. (A) Prétraitement à l'amantadine, en stabilisant spécifiquement les fosses recouvertes de clathrine, réduit l'absorption des NPs A546-T4 par les cellules A549 d'une manière dépendante de la concentration. (B) Prétraitement avec l'inhibiteur de la kinase PI3, Wortmannine, a également réduit l'absorption d'A546-T4 d'une manière dépendante de la concentration. (C) Une image de cellules confocales superposées obtenue avec un objectif 60 × avec les procapsides A546-T4 internalisées (jaune), lysosomes colorés au LysoTracker Blue (bleu), et les taches qui se chevauchent (blanc). (barre d'échelle, 10 um.) (D) Une image confocale montre la vue d'ensemble des cellules traitées contenant des portions qui se chevauchent (taches blanches) de lysosomes (bleu) avec des procapsides A546-T4 (jaune). L'image a été obtenue à l'aide d'un objectif 20x. (barre d'échelle, 50 m.) Crédit :Liu JL, et al. (Publié en ligne avant impression le 26 août 2014) Enzyme virale encapsidée par des nanoparticules et ADN restructuré pour l'administration cellulaire et l'expression génique. Crédit :Liu JL, et al. (2014) Enzyme virale encapsidée par des nanoparticules et ADN restructuré pour l'administration cellulaire et l'expression génique. Proc Natl Acad Sci USA Publié en ligne avant impression le 26 août 2014. doi:10.1073/pnas.1321940111
Liu ajoute que son laboratoire a également étudié l'imagerie cellulaire et l'administration de médicaments/gènes aux cellules eucaryotes à l'aide de nanoparticules sans queue T4, dont les chercheurs ont démontré qu'ils pouvaient pénétrer dans les cellules eucaryotes sans provoquer la mort cellulaire.
Un exemple spécifique d'applications thérapeutiques potentielles de médicaments et de gènes en aval résultant de la nouvelle approche est l'administration de la protéine toxique et du plasmide linéaire qui produit des peptides ou des anticorps neutralisants dans des cellules cancéreuses ciblées affichant des marqueurs spécifiques du cancer à l'aide de protéines de liaison aux marqueurs SOC + HOC de haute affinité sur le surface des capsides, tandis qu'un autre exemple consiste à utiliser le système pour la thérapie génique du VIH.
Liu ajoute qu'il existe plusieurs voies pour utiliser ce système pour la thérapie génique :
En plus de l'imagerie diagnostique et cellulaire, le système gène-protéine des nanoparticules T4 peut fournir des gènes réparés pour corriger les maladies génétiques humaines - par exemple, inverser le déficit en adénosine désaminase (ADA) en introduisant le complexe protéine-ADN pour exprimer l'ADA dans les cellules souches. Autres grands domaines de recherche impactés par les technologies de thérapie génique, comme les défauts génétiques, cancer, maladies neurologiques chez l'adulte, et vieillir lui-même, peuvent également bénéficier de cette étude.
Avancer, les scientifiques souhaitent développer davantage de procapsides T4 contenant de l'exonucléase et d'autres recombinases ainsi qu'un ADN cible modifié pour démontrer que les capsides T4 résultantes peuvent insérer le gène dans une lignée de cellules souches présentant une déficience génétique. "En outre, " Liu conclut, « nous travaillons à adapter notre système pour fournir des peptides ou des anticorps thérapeutiques aux cellules exposées ou infectées par des agents de biomenace, tels que les toxines protéiques ou les virus, neutralisation efficace des effets des toxines. Le traitement et la guérison des cellules et des tissus exposés à de tels agents sont d'un grand intérêt pour notre communauté de recherche en biodéfense."
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