Dans la biosynthèse de l'hème, l'étape terminale est l'insertion du fer ferreux dans la protoporphyrine IX (PPIX) par l'enzyme ferrochélatase. Dans des conditions physiologiques, de petites quantités de zinc protoporphyrine IX (ZnPP) sont également formées. Les concentrations de ZnPP et de PPIX dans les cellules érythroïdes sont typiquement altérées par des conditions qui affectent la disponibilité du fer ferreux, augmenter les montants de PPIX, ou diminuer l'activité enzymatique de la ferrochélatase. Malheureusement, la méthode de quantification standard basée sur HPLC est longue et compliquée. Alternatives, trop, se sont avérés trop exigeants sur le plan technique ou encombrants pour une adoption générale. Pour la mesure du ZnPP seul, un fluorimètre frontal portable, l'hématofluoromètre, est disponible dans le commerce. Encore, son utilisation est limitée par une fluorescence de fond élevée d'autres constituants du sang, ce qui rend inévitable le lavage des échantillons.
Une équipe de recherche dirigée par Georg Hennig de la Klinikum der Universität München (Allemagne) a maintenant développé une nouvelle méthode de quantification simultanée de ZnPP et de PPIX dans des échantillons de sang non lavés. Il est basé sur une excitation à double longueur d'onde pour éliminer efficacement la fluorescence de fond d'autres constituants du sang. Les résultats obtenus étaient étroitement corrélés avec les déterminations par un test HPLC de référence.
La clé du succès était le choix des longueurs d'onde d'excitation appropriées. Les deux doivent subir une absorption pratiquement identique et leur séparation spectrale doit être faible, de sorte que les profondeurs de pénétration des photons sont essentiellement les mêmes. L'efficacité d'excitation des fluorophores responsables de l'autofluorescence ne doit différer que très peu entre les deux longueurs d'onde d'excitation, de sorte que la soustraction des spectres d'émission élimine efficacement l'autofluorescence. En revanche, le fluorophore d'analyte doit présenter une grande différence d'efficacité d'excitation entre ces deux longueurs d'onde d'excitation, de sorte que la différence entre les spectres d'émission est grande et n'élimine pas le signal du fluorophore de l'analyte.
C'est le cas pour 425 nm (le maximum d'excitation de fluorescence du ZnPP, maximum d'émission à 593 nm) et 407 nm comme longueur d'onde correspondante avec une absorption d'hème oxygénée identique, mais une efficacité d'excitation du ZnPP nettement inférieure. De plus, lorsque la longueur d'onde d'excitation à 407 nm se rapproche du maximum d'excitation PPIX à 397 nm, le spectre d'émission montre un pic d'émission de fluorescence PPIX prononcé, qui se trouve à 627 nm. Comme l'efficacité d'excitation du PPIX est beaucoup plus faible à 425 nm, le pic d'émission de fluorescence PPIX n'est pas éliminé dans le spectre de différence et peut être évalué avec le signal ZnPP.
La nouvelle approche pourrait être mise en œuvre de manière simple et économique dans un dispositif à utiliser dans des conditions de terrain. En outre, il pourrait réduire l'autofluorescence dans les tissus tels que la muqueuse buccale in vivo, permettant des mesures non invasives de ZnPP et PPIX. (Texte fourni par K. Maedefessel-Herrmann)
