Dans les réactions chimiques catalysées par une enzyme, l'enzyme réduit la quantité d'énergie d'activation requise en se liant temporairement au substrat et en le tordant à l'état tendu. Le k (catalyseur) ou "kcat" pour la réaction se réfère à la constante indépendante de la concentration pour la vitesse à laquelle une enzyme particulière peut métaboliser un substrat en une molécule de produit. Pour calculer kcat, les scientifiques mélangent d'abord plusieurs tubes à essai avec différentes concentrations de substrat (connu sous le nom de «dosage enzymatique») et les testent à intervalles de temps constants avec un spectrophotomètre pour mesurer les concentrations croissantes de molécules de produit. Ces données sont ensuite tracées sur un graphique et analysées.

Calculer les vitesses initiales

Tracer un graphique de la concentration du produit en fonction du temps pour les données du premier tube à essai du test enzymatique. Remarque: l'axe horizontal doit être «heure» et l'axe vertical doit être «concentration du produit».

Calculez la droite de régression linéaire pour les points de données que vous avez tracés dans la section 1, étape 1. Pendant Excel et le graphique les calculateurs peuvent facilement déterminer ce modèle linéaire, vous pouvez obtenir une estimation de la pente de la droite de régression en divisant la différence de concentration du produit entre les points de données adjacents par leur différence de temps.

Enregistrer la pente de la droite de régression linéaire Section 1, étape 2 en tant que «vitesse de réaction initiale (Vo)». Remarque: dans le modèle de droite de régression "[concentration du produit] = m [temps] + b," le coefficient "m" est la pente.

Répétez les étapes 1, 2 et 3 pour le reste des éprouvettes dans le test.

Calcul de Vmax

Tracer l'inverse de la concentration du substrat pour chaque tube à essai par rapport à l'inverse de sa vitesse de réaction initiale (à partir de la section 1, étape 4). Par exemple, si la vitesse initiale pour un tube à essai avec une concentration de substrat initiale de 50 micromoles (uM) était de 80 uM /s, les inverses seraient de 1/50 uM pour la concentration du substrat et de 1/80 uM /s pour le rapidité. Remarque: la concentration de substrat inverse doit être sur l'axe horizontal, et la vitesse initiale inverse doit être sur l'axe vertical.

Remarque: la concentration du substrat doit être sur l'axe horizontal, et la vitesse de réaction initiale doit être sur le Axe vertical.

Déterminez la droite de régression linéaire pour le graphique que vous avez tracé dans la section 2, étape 1. Remarque: parce que vous devez connaître l'intersection de y pour la droite de régression, vous devez entrer les points de la section 2, Étape 1 dans Excel ou une calculatrice graphique et utilisez la fonctionnalité de modélisation de régression intégrée.

Divisez 1 par l'intersection de y à partir de la ligne de régression linéaire. Cela vous donnera la valeur de l'inverse de Vmax, la vitesse de réaction maximale de l'enzyme. Remarque: si le modèle de régression linéaire prend la forme "[Inverse Vo] = m [Conc. Substrat inverse] + b," alors la valeur de "b" serait l'intersection de y. Diviser 1 par "b" pour calculer l'inverse de Vmax.

Diviser 1 par le résultat de la section 2, étape 3 pour calculer la valeur réelle de Vmax.

Déterminer la concentration de l'enzyme dans le test d'origine (voir les données brutes). Remarque: la concentration enzymatique est la même pour tous les tubes à essai;

Diviser le Vmax (à partir de la section 2, étape 4) par la concentration enzymatique (à partir de la section 2, étape 5). Le résultat est la valeur de Kcat.