Par Anne Mullenniex Mis à jour le 24 mars 2022
Quantifiez votre échantillon d’ARN en mesurant son absorbance de la lumière ultraviolette (UV). Un spectrophotomètre à nanogouttes n’utilisera qu’un ou deux microlitres de votre échantillon, que vous pourrez récupérer. D'autres spectrophotomètres nécessitent un échantillon beaucoup plus grand. Le coefficient d'extinction pour les nucléotides à une longueur d'onde UV de 260 nm dans un trajet lumineux de 1 cm est de 20. Sur la base de ce coefficient d'extinction, l'absorbance de 40 µg/ml d'ARN dans les mêmes conditions est de un. Grâce à ces informations, vous pouvez calculer la concentration de votre échantillon d'ARN.
Faites une dilution, si nécessaire, de votre échantillon. Une dilution standard pour une microcuvette est de 1:40. Effectuez cette dilution en ajoutant 2 µL d'échantillon d'ARN à 78 µL d'eau stérile.
Suivez les protocoles de votre spectrophotomètre particulier pour calibrer la machine à l'aide d'un blanc, puis déterminez la densité optique de votre échantillon à une longueur d'onde UV de 260 nm.
Multipliez l'absorbance de votre échantillon par votre facteur de dilution par 40 μg d'ARN/mL. L'équation serait :« Concentration d'ARN (µg/ml) =(OD260) x (facteur de dilution) x (40 µg d'ARN/ml)/(1 unité OD260) » (Hofstra.edu). Par exemple :Si vous avez dilué votre échantillon au 1:40 et que votre lecture d'absorbance était de 0,08, vous multiplieriez 0,08 x 40 x 40 =128 µg/ml =0,13. µg/μL
Déterminez la pureté de votre échantillon en prenant une autre lecture d’absorbance à une longueur d’onde UV de 280 nm. Le rapport OD 260/OD 280 indiquera si – et à quel niveau – votre échantillon est contaminé par des protéines ou du phénol. Un résultat de 1,8 à 2,0 indique un ARN de qualité.
N'oubliez pas de calibrer votre spectrophotomètre. L'exécution d'un gel électrophorétique rapide confirmera les résultats de vos spécifications.
Ne présumez pas que votre échantillon est pur. Prendre le temps d'établir un rapport OD260/OD280 permet d'économiser du temps et de l'argent à long terme.