C'était plus de 10 ans dans la fabrication, mais quand il s'agissait de découvrir les secrets de la structure moléculaire des enzymes, la persévérance a payé. En étudiant et en comparant les enzymes de dégradation de la cellulose de deux champignons, des chercheurs du Laboratoire national des énergies renouvelables (NREL) du ministère de l'Énergie ont identifié des régions sur ces enzymes qui peuvent être ciblées par génie génétique pour aider à décomposer la cellulose plus rapidement.

Nouvellement publié dans Communication Nature , "Engineering Enhanced cellobiohydrolase activity" décrit l'étude de longue durée du NREL sur les cellobiohydrolases fongiques (CBH) - des enzymes qui utilisent l'hydrolyse comme principale chimie pour dégrader la cellulose - Trichoderma reesei (TrCel7A) et Pénicillium funiculosum (PfCel7A). Des années de recherche méticuleuse ont donné de grandes récompenses :l'équipe a acquis une meilleure compréhension des relations structure-activité de ces enzymes pour prédire les meilleurs endroits pour apporter des changements et des améliorations.

Dans la nature comme dans les procédés industriels, les enzymes de cette famille sont parmi les enzymes les plus importantes pour décomposer la cellulose. Un projeté 2, Une usine d'éthanol cellulosique de 000 tonnes par jour pourrait potentiellement en utiliser jusqu'à 5, 000 tonnes d'enzyme par an, et la moitié de ce cocktail d'enzymes pourrait provenir de cette famille d'enzymes. « Au cours des dernières décennies, il y a eu un effort pour essayer de comprendre et d'améliorer les biocatalyseurs de cette famille d'enzymes clé, " a déclaré Gregg Beckham, chef de groupe au NREL et auteur principal de l'étude. "Plus l'enzyme est efficace, le moins d'enzyme utilisé, et donc le processus est moins cher. Cependant, nous avons encore un long chemin à parcourir pour être en mesure d'apporter des améliorations à une capacité prédictive."

Puis, en 2005, Les chercheurs du NREL Mike Himmel, Steve Decker, et Bill Adney a découvert un CBH à partir d'un champignon différent, PfCel7A, et a constaté qu'il fonctionne 60 pour cent mieux que TrCel7A. "Cela nous a surpris que cette enzyme soit tellement meilleure que la norme de l'industrie, " dit Decker, qui ont dirigé la tâche après qu'Adney ait quitté NREL. "Nous avons mené de nombreuses expériences au cours des dernières années pour nous assurer que l'activité était réelle. Ensuite, bien sûr, nous voulions savoir pourquoi c'était mieux."

« Si nous pouvions comprendre les différences structurelles, alors nous pourrions potentiellement utiliser ces informations pour concevoir de meilleures enzymes, ce qui à son tour pourrait aider à réduire le coût de la production de biocarburants cellulosiques et biochimiques, " a déclaré Beckham. " Compte tenu du défi de travailler avec ces enzymes, il a fallu à l'équipe de NREL sept ans de travail expérimental approfondi pour développer les outils nécessaires pour s'assurer qu'il existe quelques points chauds sur ces deux CBH qui peuvent être modifiés pour les rendre plus performants. »

Selon Decker, "À l'époque, les outils de génie génétique chez Trichoderma étaient très limités, mais nous savions grâce à des travaux antérieurs que d'autres hôtes avaient des problèmes pour exprimer ces protéines. En gros, nous sommes partis de zéro et avons construit notre propre système interne de souches hôtes de T. reesei, vecteurs, et les protocoles de transformation et de criblage. Par rapport à des systèmes bien développés comme E. coli, la faible efficacité de transformation de T. reesei, processus de sélection fastidieux, croissance lente, et le faible rendement en protéines a rendu cette opération difficile. Chaque souche que nous avons construite a pris des mois, de la conception aux tests finaux. »

La découverte s'est déroulée alors que le NREL examinait de près les similitudes entre TrCel7A et PfCel7A, puis s'efforçait d'isoler les différences. Les deux enzymes ont une architecture à trois domaines :la molécule de liaison aux glucides qui l'attache à la cellulose; le domaine catalytique qui décompose la cellulose; et le lien qui relie ces deux domaines ensemble. L'équipe de recherche a ensuite mené des expériences d'échange de domaine en créant une bibliothèque de chimères, qui est une collection d'enzymes mutantes créées à partir des deux enzymes mères.

"Avec trois domaines entre deux parents, cela fait huit combinaisons au total, " a déclaré Beckham. " Nous avons testé les différentes combinaisons pour savoir quelle zone fournit à l'enzyme les meilleures performances, et peut-être sans surprise, avec le recul, c'est le domaine catalytique."

Avec ces découvertes, les chercheurs ont ensuite comparé les domaines catalytiques de TrCel7A et PfCel7A et ont trouvé huit domaines différents. En continuant à affiner les possibilités, l'équipe a pris le parent TrCel7A et a apporté des modifications, un à la fois, dans ces huit domaines et a découvert deux modifications importantes qui ont permis à TrCel7A de fonctionner presque au niveau du parent PfCel7A.

"Ces deux là, de très petits changements sur cette énorme protéine ont essentiellement doublé les performances de TrCel7A, " a déclaré Beckham. " Ce que cela enseigne aux chercheurs qui font de l'ingénierie des protéines sur ces enzymes incroyablement difficiles, c'est qu'il y a des changements très mineurs dans ce domaine catalytique qui peuvent être modifiés pour affecter considérablement les performances de l'enzyme, le rendant capable de décomposer la cellulose plus rapidement et permettant ainsi aux processus industriels d'utiliser moins d'enzymes. »

"Nous savions que la découverte de PfCel7A était importante à l'époque, mais la voie à suivre n'était pas tout à fait claire, " dit Himmel, le chef de projet global. "Nous nous sommes attaqués à la famille de cellulases la plus difficile à améliorer en premier, et il s'ensuit que les enzymes dégradant la biomasse d'autres familles peuvent être rendues actives au maximum dans un processus plus rationalisé, avec moins de recherche et développement. C'est la fusion de la biochimie expérimentale et de la science informatique qui a amené cette étude à Communication Nature et ce résultat n'a été possible qu'avec un financement soutenu du Bureau des technologies bioénergétiques."

L'objectif ultime de l'équipe NREL est d'aider d'autres chercheurs à passer au crible la montagne de données génomiques pour trouver de meilleures enzymes, sur la seule base de leur séquence génétique. "Dans 10 ans, ce serait tellement excitant de pouvoir s'asseoir avec des milliers de séquences enzymatiques de cette famille et de pouvoir prédire lesquelles essayer, " a déclaré Beckham. " Cette étude est une étape sur un très long chemin, mais c'est un objectif louable."