Nouveaux colorants à base de rhodamine synthétisés au Lavis Lab. Crédit :Jonathan B. Grimm
Avec une nouvelle technique pour fabriquer un spectre de teintures éclatantes, les chimistes ne courent plus après les arcs-en-ciel.
L'échange de blocs de construction chimiques spécifiques dans des molécules fluorescentes appelées rhodamines peut générer presque toutes les couleurs souhaitées par les scientifiques - ROYGBIV et au-delà, les chercheurs rapportent le 4 septembre 2017 dans la revue Méthodes naturelles .
Le travail offre aux scientifiques un moyen d'ajuster délibérément les propriétés des colorants existants, les rendant plus audacieux, plus lumineux, et plus perméable aux cellules aussi. Une palette de colorants aussi étendue pourrait aider les chercheurs à mieux éclairer le fonctionnement interne des cellules, dit le responsable de l'étude Luke Lavis, un chef de groupe au campus de recherche Janelia du Howard Hughes Medical Institute à Ashburn, Virginie. Son équipe a allumé des noyaux cellulaires, fait briller les cerveaux des larves de mouches des fruits, et a mis en évidence les neurones du cortex visuel chez les souris qui avaient de minuscules fenêtres en verre intégrées dans leur crâne.
Les scientifiques avaient l'habitude de concocter différents colorants principalement par essais et erreurs, dit Lavis. "Maintenant, nous avons compris les règles, et nous pouvons fabriquer presque n'importe quelle couleur. » La méthode de son équipe pourrait permettre aux chimistes de synthétiser des centaines de couleurs différentes.
Une histoire lumineuse
Jusqu'à il y a environ 20 ans, les scientifiques se sont appuyés sur des colorants fluorescents chimiques pour rendre les molécules biologiques visibles. Pour jeter un coup d'œil à l'intérieur des cellules, coloration des organites, et d'autres expériences d'imagerie, "la chimie était roi, " Lavis a écrit dans un 13 juillet, Perspective 2017 dans la revue Biochimie . Puis, le roi a été chassé du trône par une protéine de méduse verte brillante appelée GFP.
En 1994, les scientifiques ont signalé l'utilisation d'une astuce génétique pour virer la GFP, la protéine fluorescente verte, sur d'autres protéines cellulaires; c'est comme forcer les protéines à tenir un bâton lumineux. Cette astuce a donné aux chercheurs un moyen plus simple de suivre les mouvements des protéines au microscope - sans utiliser de colorants synthétiques coûteux. L'innovation a explosé dans le domaine de l'imagerie biologique. En 2007, Le mélange des scientifiques de GFP et de deux autres protéines fluorescentes leur a permis de peindre sur les neurones de souris un défilé de couleurs vives dans une technique connue sous le nom de « Brainbow ». Un an plus tard, la découverte et le développement de la GFP ont valu le prix Nobel de chimie à trois scientifiques, dont feu Roger Tsien, un enquêteur HHMI.
Purification d'un nouveau dérivé de Janelia Fluor 549 par chromatographie flash. Crédit :Luke D. Lavis
Mais GFP a aussi des côtés sombres. C'est une molécule relativement maladroite construite à partir de l'ensemble limité d'acides aminés naturels. La GFP n'est donc pas toujours assez brillante pour révéler ce que les scientifiques essaient de voir.
Les chercheurs se sont donc tournés vers la chimie. Les scientifiques avaient développé des microscopes de pointe et de nouvelles techniques pour marquer le contenu cellulaire, Lavis dit, mais les colorants pour marquer les molécules à l'intérieur des cellules étaient encore bloqués au XIXe siècle. Son équipe s'est concentrée sur les rhodamines, parce qu'ils sont particulièrement brillants et perméables aux cellules - ils se glissent donc facilement dans les cellules et les font briller. Mais malgré le travail avec les rhodamines depuis plus de 100 ans, les chimistes n'avaient créé que quelques dizaines de couleurs, et la plupart étaient des nuances similaires allant du vert à l'orange.
Jusque récemment, faire de nouvelles rhodamines n'était pas facile. Les scientifiques utilisaient encore des techniques des premiers jours de la chimie, faire bouillir des ingrédients chimiques dans de l'acide sulfurique. Cela oblige les molécules à se lier dans ce qu'on appelle une réaction de condensation. Le mélange de différents blocs de construction peut produire des colorants nouveaux et inhabituels. Mais les ingrédients devaient être suffisamment résistants pour survivre au bain d'acide bouillant, ce qui ne laissait pas beaucoup d'options.
Fais-le briller
En 2011, L'équipe de Lavis a développé une nouvelle façon de bricoler la structure des rhodamines, dans des conditions plus douces. En utilisant une réaction déclenchée par le palladium métallique, les chercheurs pouvaient sauter l'étape acide et construire des colorants avec des blocs de construction plus compliqués que ceux utilisés auparavant.
Ce gentil, une approche plus douce a ouvert la porte à un nouveau monde de colorants, et l'équipe de Lavis a plongé. Quatre ans plus tard, ils ont révélé les colorants Janelia Fluor, molécules fluorescentes jusqu'à 50 fois plus brillantes que les autres colorants, et plus stable aussi. Le secret derrière les colorants Janelia Fluor est un minuscule appendice de forme carrée appelé anneau azétidine - une structure rendue possible uniquement par la nouvelle approche chimique de Lavis.
Les scientifiques peuvent utiliser diverses stratégies pour amener les molécules de colorant brillant sur la protéine qu'ils souhaitent étudier. Puis, ils peuvent se concentrer sur la protéine allumée, et regardez-le se tortiller et interagir avec d'autres molécules - sans le flou de fond habituel.
Nouveaux colorants à base de rhodamine synthétisés au Lavis Lab et fluorescents sous illumination UV. Crédit :Jonathan B. Grimm
"Pour nous, ce fut une révolution totale dans le domaine de l'imagerie de la molécule unique, " dit le biologiste moléculaire Xavier Darzacq de l'Université de Californie, Berkeley. Avant d'utiliser les colorants Janelia Fluor, les protéines du facteur de transcription à marquage fluorescent que son équipe a étudiées étaient trop faibles pour être capturées dans des images nettes. Les chercheurs ont dû maintenir l'obturateur de la caméra ouvert pendant 10 millisecondes pour collecter suffisamment de lumière. C'est assez long pour que les protéines se promènent, ainsi l'image deviendrait floue - comme une photographie d'un bambin agité. Mais les colorants Janelia sont suffisamment brillants pour que son équipe puisse capturer des molécules en action en seulement une milliseconde, dit Darzacq. De tels instantanés rapides ont permis à son équipe de faire des expériences en laboratoire qu'il décrit comme « tout simplement impensables il y a quelques années ».
Maintenant, Le groupe de Lavis a trouvé comment affiner ses colorants fluorescents, en peaufinant encore plus la structure des rhodamines. Les rhodamines ont une conception de base à quatre anneaux avec des groupes d'atomes dépassant de différentes parties des anneaux. Dans des travaux antérieurs, les scientifiques ont développé des stratégies pour les colorants grossiers - coupez un appendice entier ici, et vous pouvez faire un colorant vert. Pop dans un atome de silicium là-bas, et tu as du rouge. Lavis a découvert qu'en plaçant soigneusement quelques nouveaux atomes dans la structure du colorant, la couleur et les propriétés chimiques des colorants pourraient également être affinées, permettant de nombreuses nuances de vert à partir d'un seul échafaudage. C'est comme passer du paquet classique de huit crayons à la boîte géante de 64.
Dans un document séparé, publié le 9 août 2017 dans la revue ACS Science centrale , l'équipe a décrit un moyen de modifier l'anneau inférieur de la structure du colorant.
"L'essentiel est que tout soit modulaire et rationnel, " Lavis dit. Sélectionnez les bons atomes, il explique, et les chimistes peuvent concevoir des colorants avec presque toutes les propriétés qu'ils souhaitent.
Son groupe a greffé différents produits chimiques sur des rhodamines, puis analysé les propriétés des nouveaux colorants. "Personne n'avait jamais examiné les rhodamines de cette manière systématique auparavant, " déclare le co-auteur principal Jonathan Grimm, un scientifique principal à Janelia.
Les colorants sont synthétisés en une seule étape avec des ingrédients peu coûteux, dit Lavis. Cela rend les colorants moins chers que les alternatives commerciales - quelques centimes par flacon. Le faible coût a permis à son équipe de partager son travail avec des scientifiques du monde entier. Lavis, Grimm, et ses collègues ont maintenant expédié des milliers de flacons à des centaines de laboratoires différents.
"Ces colorants changent complètement la donne, " dit Ethan Garner, un biologiste des cellules bactériennes de l'Université Harvard qui les a utilisés pour tracer le chemin de molécules uniques dans son laboratoire. Le seul inconvénient était que les scientifiques n'avaient pas beaucoup de couleurs différentes à choisir. Mais maintenant, il dit, avec le travail de Lavis, "Ils peuvent en fait couvrir toute la gamme spectrale."