Par Palmer Owyoung · Mis à jour le 24 mars 2022
Les bactéries sont cultivées sur gélose dans des boîtes de Pétri, formant des colonies visibles représentant des groupes de cellules. Alors qu'un simple décompte des colonies peut fournir une estimation rapide de la charge bactérienne, les méthodes quantitatives telles que le dénombrement sur plaques viables donnent à la fois des chiffres absolus et des informations qualitatives sur la façon dont différentes conditions affectent la croissance. Étant donné qu'une seule boîte peut contenir des milliards de cellules, la culture doit d'abord être diluée en série jusqu'à un niveau permettant de compter les colonies individuelles de manière fiable.
Commencez dans un tube stérile de 1,5 ml. Pipeter 10 µL de la culture de départ dans 90 µL de milieu de dilution stérile (par exemple, une solution saline tamponnée au phosphate). Fermez le tube, vortexez doucement et vous obtenez une dilution à 10⁻¹. Répétez le transfert de 10 µL dans 90 µL frais de milieu pour générer une dilution de 10⁻², et ainsi de suite. Continuez jusqu'à atteindre une dilution comprise entre 10⁻⁴ et 10⁻¹⁰. Étiquetez chaque tube (10‑1, 10‑2, …) pour garder une trace du facteur de dilution.
Prélever 10 µL du tube le plus dilué qui donne encore des colonies dénombrables (généralement 30 à 300 par plaque). Étalez l’inoculum uniformément sur la surface de la gélose avec un épandeur en verre, faites pivoter la plaque de 90° et répétez. Préparez au moins trois plaques par dilution pour garantir la confiance statistique. Laissez l'épandeur sécher sur une flamme ou sur un banc pendant quelques minutes, puis replacez les couvercles et incubez à la température optimale pour l'organisme (généralement 35 à 37°C) pendant 12 à 16 heures.
Après l'incubation, inspectez chaque plaque pour un nombre dénombrable de colonies. Marquez le fond du plat (pas le couvercle) avec un marqueur permanent à la position de chaque colonie et comptez les points. Choisissez des plaques contenant entre 30 et 300 colonies pour des statistiques précises.
Calculez les unités formant colonie (UFC) par millilitre de la culture d'origine à l'aide de la formule :
CFU/mL = (nombre de colonies) × 10×10ⁿ
où n est l'exposant négatif du facteur de dilution (par exemple, pour une dilution 10⁻⁷, n = 7). Le facteur 10 représente le volume d'inoculum de 10 µL.
Stérilisez l'épandeur dans de l'éthanol à 70 %, allumez-le avec la flamme d'un bec Bunsen, laissez l'alcool brûler et refroidissez-le sur la surface de la gélose sèche. Cela tue tous les microbes résiduels avant le placage.
Manipulez toutes les cultures bactériennes comme étant potentiellement dangereuses. Suivez les directives institutionnelles en matière de biosécurité et utilisez un équipement de protection individuelle approprié.