Par Dianne Hermance, mise à jour le 30 août 2022
L'électrophorèse sur gel est une technique fondamentale en biologie moléculaire qui sépare les acides nucléiques et les protéines en fonction de leur taille et de leur charge. En appliquant un champ électrique à travers une matrice de gel, les molécules chargées migrent à des vitesses inversement proportionnelles à leur longueur, permettant une estimation précise de leur taille.
Le milieu le plus courant est l’agarose, un polysaccharide purifié dérivé d’algues. L'agarose forme un réseau poreux qui permet à des molécules de différentes tailles de se déplacer à des vitesses distinctes. Pour les fragments inférieurs à ~200 pb, un gel de polyacrylamide offre une résolution plus élevée, bien qu'il nécessite une manipulation prudente en raison de ses propriétés neurotoxiques.
Avant de la verser, la solution de gel est mélangée à un colorant intercalant, traditionnellement le bromure d'éthidium (EtBr), qui émet une fluorescence sous éclairage UV lorsqu'il est lié à l'ADN. Les protocoles modernes utilisent de plus en plus d'alternatives plus sûres telles que SYBRSafe ou GelRed, bien qu'à un coût plus élevé.
Lors du moulage du gel, un peigne crée des puits qui sont ensuite remplis d'un échantillon mélangé à un colorant de chargement. Le colorant suit la progression de l'échantillon et ajoute de la densité pour empêcher la diffusion.
Une fois le gel solidifié, il est immergé dans un tampon de fonctionnement compatible. Les puits sont chargés d'échantillons d'ADN ou de protéines et une échelle d'ADN (un ensemble de fragments de tailles connues) est placée dans un puits de référence. Une tension constante (généralement 80-120 V) entraîne les molécules chargées négativement vers l'électrode positive.
Après électrophorèse, le gel est exposé à un transilluminateur UV. Les bandes correspondant à l'ADN ou à l'ARN sont fluorescentes ; les bandes de protéines peuvent être visualisées par coloration au Coomassie ou à l'argent. La distance de migration de chaque bande est comparée à l'échelle pour déduire la taille des fragments, tandis que l'intensité de la bande indique la concentration relative.
Une manipulation prudente de l'EtBr ou de ses alternatives est essentielle, car ces composés peuvent s'intercaler dans l'ADN et, dans le cas de l'EtBr, sont considérés comme mutagènes.
Des résultats de haute qualité dépendent d’une préparation méticuleuse du gel :utilisation de tampons fraîchement préparés et sans RNase ; assurer une épaisseur de gel uniforme ; et éviter la contamination croisée entre les échantillons. Des bandes propres et bien résolues, sans bavures, indiquent une séparation réussie et des analyses précises en aval.
L'électrophorèse sur gel est à la base d'un large éventail d'applications, depuis les empreintes génétiques en médecine légale jusqu'à l'évaluation des produits de PCR, le clonage de fragments et la vérification de la pureté des protéines. Une interprétation fiable des données électrophorétiques est donc essentielle à la fois pour la recherche et pour les diagnostics cliniques.