photo/iStock/GettyImages
Le clonage moléculaire est une technique fondamentale de la biologie moderne que chaque étudiant et chercheur devrait maîtriser. En utilisant des enzymes de restriction, les scientifiques coupent l'ADN double brin en fragments gérables qui peuvent ensuite être insérés dans un vecteur plasmidique et exprimés dans un hôte bactérien.
Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui se lient à de courtes séquences d'ADN spécifiques, appelées sites de restriction, et clivent le squelette phosphodiester précisément à ces positions. Avec plus de 90 enzymes distinctes cataloguées, chacune cible une séquence unique et coupe son site jusqu'à 5 000 fois plus rapidement que n'importe quelle séquence non reconnue.
Lorsqu'une enzyme de restriction coupe, les terminaisons résultantes peuvent être soit des extrémités collantes ou extrémités émoussées . Les extrémités collantes contiennent des surplombs monocaténaires complémentaires les uns des autres ; cette « adhérence » entraîne un appariement rapide et spécifique entre deux fragments. Les extrémités émoussées, en revanche, ont des brins parfaitement appariés sans surplomb, ce qui les rend moins sélectifs lors de la ligature.
Étant donné que les extrémités collantes ne s'associent qu'à leurs surplombs complémentaires, le fragment inséré peut pénétrer dans le plasmide selon une orientation unique et définie. Les extrémités émoussées n'offrent pas un tel contrôle directionnel, permettant au fragment de se ligaturer dans une orientation tête-bêche ou queue-bêche.
Bien que les extrémités collantes et émoussées nécessitent en fin de compte de l'ADN ligase pour former un brin continu, les extrémités collantes réduisent la quantité d'ADN nécessaire pour une réaction réussie. Leurs surplombs complémentaires se trouvent plus rapidement et plus efficacement, permettant à la ligature de se dérouler avec des concentrations plus faibles d'insert et de vecteur.
En revanche, les extrémités franches doivent dépendre uniquement de la concentration de molécules d'ADN pour entrer en collision et s'aligner, ce qui nécessite souvent des quantités d'entrée plus élevées pour obtenir des efficacités de ligature comparables.
L’une des caractéristiques les plus puissantes des enzymes à extrémité collante est que différentes enzymes peuvent générer des surplombs identiques, même si elles reconnaissent des séquences distinctes. Par exemple, BamHI , BglII , et Sau3A tous produisent le même surplomb collant de 5’-GATC-3’. Cette redondance augmente la probabilité qu'une paire de sites appropriés encadre un gène d'intérêt, donnant ainsi aux chercheurs la flexibilité de choisir la stratégie de restriction optimale.
Les plasmides modifiés peuvent également placer des sites de restriction adjacents les uns aux autres, améliorant encore la polyvalence des conceptions de clonage.