Comstock/Comstock/Getty Images
Avant que l’ADN puisse être séquencé ou modifié, les chercheurs doivent d’abord l’isoler de la matrice cellulaire. Bien que les cellules contiennent un mélange de protéines, de lipides, de glucides et de petites molécules, les propriétés chimiques uniques de l'ADN lui permettent d'être séparé et purifié pour une analyse en aval.
La première étape de tout flux de travail d’extraction d’ADN est la lyse cellulaire. En fonction du type d'échantillon et de la pureté requise, les laboratoires choisissent entre des méthodes mécaniques, enzymatiques ou basées sur des détergents. Les détergents solubilisent les membranes cellulaires, les ondes ultrasonores à haute fréquence (sonication) perturbent les membranes par cavitation et le battement des billes (où les billes de verre vibrent contre l'échantillon) provoque une perturbation physique rapide qui libère des acides nucléiques.
Lorsque la vitesse l’emporte sur la pureté, les scientifiques ont parfois recours à un nettoyage minimal. L'ajout de protéinaseK dégrade la majorité des protéines, permettant à l'échantillon d'être utilisé avec seulement une légère purification. Alternativement, des concentrations élevées de sel (par exemple, acétate d’ammonium ou de potassium) précipitent les protéines, mais de nombreux autres contaminants subsistent. Ces méthodes conviennent au criblage rapide, mais ne conviennent pas aux applications nécessitant un ADN de haute qualité.
L’extraction au phénol‑chloroforme reste une technique classique, même si elle est désormais moins courante en raison de sa toxicité et de l’intensité du travail. Les cellules sont lysées avec un détergent, puis mélangées avec un mélange phénol :chloroforme :alcool isoamylique. Lors de la centrifugation, la solution se sépare en une phase aqueuse (en bas) qui retient l'ADN et une phase organique (en haut) qui capture les protéines et les lipides. Un contrôle minutieux de la concentration en sel et du pH est essentiel pour une récupération optimale. Le phénol et le chloroforme étant dangereux, de nombreux laboratoires ont opté pour des alternatives plus sûres.
La chromatographie par échange d'anions offre une pureté et une reproductibilité supérieures. La matrice de la colonne contient des groupes chargés positivement qui se lient à l'ADN chargé négativement. Les protéines, l'ARN et autres contaminants sont éliminés et l'ADN est ensuite élué avec un tampon à haute teneur en sel. Cette méthode est particulièrement utile pour la purification à l'échelle préparative.
Les kits de colonnes rotatives à base de silice sont devenus la référence en matière de purification rapide et reproductible de l’ADN. L'ADN se lie à une membrane de silice en présence de sels chaotropiques, tandis que les contaminants sont éliminés. Après un dernier rinçage à faible teneur en sel, l'ADN est élué dans un petit volume de TE ou d'eau, produisant un matériau de haute qualité en quelques minutes.
Après l'isolement, la solution d'ADN est généralement placée dans un tampon à pH contrôlé. Sa pureté est vérifiée en mesurant l'absorbance ultraviolette à 260 nm et 280 nm. Un ratio 260/280 d’environ 1,8 indique une pureté élevée, tandis que des ratios plus faibles suggèrent une contamination protéique. L'absorbance à 260 nm fournit également une estimation simple de la concentration d'ADN.