La transcription est unidirectionnelle en raison de l'asymétrie inhérente à la double hélice de l'ADN. Chaque brin d'ADN a une directionnalité spécifique, appelée direction 5' vers 3'. Cette directionnalité est déterminée par l’orientation des liaisons phosphodiester qui relient les nucléotides entre eux dans le squelette de l’ADN.

Pendant la transcription, l'ARN polymérase, l'enzyme responsable de la synthèse de l'ARN, lit la matrice d'ADN dans une direction 5' vers 3'. Cette directionnalité est cruciale car l'ARN polymérase ne peut ajouter des nucléotides à la chaîne d'ARN en croissance que dans la direction 5' vers 3'.

L'unidirectionnalité de la transcription garantit que les transcrits d'ARN sont synthétisés dans la bonne orientation, l'extrémité 5' correspondant au début du gène et l'extrémité 3' correspondant à la fin du gène. Les écarts par rapport à ce processus unidirectionnel, tels que la transcription bidirectionnelle ou la présence de séquences intermédiaires, peuvent entraîner la formation de transcrits d'ARN non fonctionnels ou tronqués.

Le caractère unidirectionnel de la transcription a également des implications sur la régulation des gènes. Divers mécanismes de régulation, tels que les séquences promotrices, les amplificateurs et les terminateurs, fonctionnent d'une manière spécifique à la séquence pour contrôler respectivement l'initiation, l'élongation et la fin de la transcription. Ces éléments régulateurs sont reconnus et utilisés par l'ARN polymérase dans la bonne direction 5' vers 3', permettant un contrôle précis de l'expression des gènes.