La méthode CRISPR améliorée offre de grandes opportunités pour la modification ciblée des gènes des plantes supérieures, tant pour la sélection que pour la recherche. L'étude, dirigée par le professeur Alain Tissier et le Dr Tom Schreiber, a été publiée dans Molecular Plant .

CRISPR/Cas est une méthode dotée d’un énorme potentiel pour la modification ciblée de gènes individuels. Toutefois, cela ne s’applique pas à toutes sortes de modifications génétiques que les sélectionneurs et les scientifiques ont sur leur liste de souhaits. Bien que les ciseaux génétiques soient idéaux pour éliminer des gènes, c’est-à-dire désactiver ou supprimer des gènes existants, ils ne fonctionnent pas bien pour insérer précisément des gènes ou remplacer des segments de gènes. Jusqu'à présent, les ciseaux génétiques se sont révélés trop inefficaces et donc peu utiles pour l'insertion ciblée de gènes dans l'ADN des plantes supérieures.

"La raison en est le mécanisme interne de réparation des cassures de l'ADN de l'usine", explique Schreiber. Ces enzymes de réparation sont immédiatement présentes dès que l’ADN est endommagé. Ils reconnaissent également les coupures douces réalisées par les ciseaux génétiques et rejoignent instantanément les deux brins d'ADN sectionnés de la double hélice. Ce collage de l’ADN coupé se produit très rapidement et de manière peu précise; il y a des pertes mineures d'informations dans lesquelles de minuscules sections d'ADN sont perdues ou ajoutées.

"Ces imprécisions ne posent pas de problème dans les projets knock-out et sont même souhaitables", explique Schreiber, "car je veux de toute façon désactiver le gène. Mais si je veux insérer un gène, cela doit être fait très précisément. Le l'information génétique doit être insérée exactement, aucun composant ne doit manquer et aucun composant supplémentaire ne peut être intégré, sinon le gène perd sa fonction et toute l'expérience est vaine."

Pour cette raison, l’insertion précise et sans cicatrice de gènes ou de segments d’ADN plus grands, médiée par CRISPR/Cas, n’a jusqu’à présent réussi que dans de rares cas individuels. Afin d'augmenter le taux de réussite de l'insertion de gènes, les scientifiques de Halle ont équipé les ciseaux génétiques d'une enzyme supplémentaire, appelée exonucléase.

Les exonucléases peuvent modifier les sites de clivage de l'ADN créés par les ciseaux génétiques de telle manière que les enzymes de réparation internes de la cellule ne peuvent plus reconnaître et réparer les dommages causés à l'ADN. Le segment d'ADN à insérer par CRISPR/Cas aurait donc suffisamment de temps pour s'intégrer à la bonne position grâce à un autre mécanisme de réparation cellulaire très précis.

Dans l'expérience, les scientifiques de Halle ont testé diverses exonucléases d'origine virale, bactérienne, végétale et humaine pour leur capacité à augmenter le nombre d'événements précis d'insertion de gènes. Ils ont introduit les ciseaux génétiques avec les exonucléases correspondantes et un segment du gène X dans les cellules des feuilles du plant de tabac Nicotiana benthamiana.

Ces cellules de tabac avaient été préalablement équipées d'un gène pour un marqueur fluorescent vert. Ils contenaient également un gène X détruit, nécessaire à la formation du colorant fluorescent vert. Cependant, le marqueur fluorescent ne peut pas être généré tant qu'une grande partie de l'information génétique du gène X est manquante.

Le marqueur vert ne peut être produit que lorsque la section manquante du gène X est réinsérée avec précision à l'aide de CRISPR/Cas, réparant ainsi le gène X. Chaque cellule avec une insertion réussie du gène émettra alors une fluorescence verte et les chercheurs pourront simplement compter le taux d'insertions réussies du gène. .

Deux des exonucléases testées, dont une de la famille des virus de l'herpès, se sont révélées particulièrement efficaces. Grâce à ceux-ci, l'équipe de Halle a réalisé 38 fois plus d'événements d'insertion de gènes parfaits qu'avec CRISPR/Cas seul.

Cette approche expérimentale a ensuite été testée avec d'autres gènes à incorporer et dans d'autres plantes, à savoir le cresson (Arabidopsis thaliana) et le blé. Étant donné que l'insertion du gène dans les plants de tabac n'a eu lieu que localement dans les feuilles, le gène intégré a été perdu dans la génération fille suivante et n'a donc été présent dans le génome que pendant une durée limitée.

C'est pourquoi chez Arabidopsis et le blé, les experts de Halle CRISPR ont tenté d'incorporer le gène dans les cellules germinales afin d'assurer un héritage stable aux générations végétales futures. Grâce aux exonucléases testées, l'inactivation de gènes stables, c'est-à-dire héréditaires, s'est avérée réussie chez Arabidopsis avec une fréquence décuplée et chez le blé chez plus de 1% des plantes filles.

"Un pour cent ne semble pas beaucoup au premier abord", explique Schreiber, "mais si un sélectionneur souhaite introduire un certain caractère dans sa plante, il lui suffira de sélectionner environ 50 à 100 plantes filles de première génération à l'aide de notre CRISPR optimisé. /Cas pour trouver une plante présentant le caractère souhaité. Cela permettrait de gagner un temps considérable par rapport aux méthodes de sélection conventionnelles, où 500 à 1 000 plantes devraient être analysées à cet effet."

La méthode CRISPR/Cas optimisée constitue donc un outil prometteur pour l’insertion ciblée de gènes dans des plantes supérieures et éventuellement dans d’autres organismes. À l’avenir, les sélectionneurs de plantes pourraient utiliser cette méthode, par exemple, pour réintroduire des gènes de résistance perdus contre des agents pathogènes provenant d’espèces sauvages ou d’anciennes variétés cultivées dans des variétés élites modernes à haut rendement. De cette façon, des caractéristiques souhaitables comme celles-ci pourraient améliorer la sélection végétale et contribuer au développement de variétés de cultures plus robustes.

Pour la science, cette approche offre de grandes opportunités pour remplacer élégamment certains gènes végétaux par des copies modifiées d’eux-mêmes en une seule étape. Ceci est particulièrement utile pour élucider la fonction des gènes.