Illustration de la méthode "homo-FRET" de l'Université Rice pour observer les réactions de phosphorylation en temps réel dans les systèmes sensoriels à deux composants chez les bactéries vivantes. Des stimuli spécifiques à l'extérieur de la cellule (en haut) initient la phosphorylation (au milieu), qui active les protéines régulatrices de la réponse qui forment des paires (en bas à droite) pour produire une cascade biochimique qui modifie finalement le comportement de la cellule. Pour observer la phosphorylation en temps réel, les chercheurs de Rice ont conçu des souches d'E. coli pour produire des étiquettes fluorescentes vertes qui dépolarisent la lumière d'un laser d'excitation uniquement lorsqu'elles interagissent par paires (en bas à droite). Crédit :Ryan Butcher/Rice University
Les biologistes synthétiques de l'Université Rice ont développé la première technologie pour observer l'activité en temps réel de certains des circuits de traitement du signal les plus courants chez les bactéries, y compris les agents pathogènes mortels qui utilisent les circuits pour augmenter leur virulence ainsi que pour développer une résistance aux antibiotiques.
Les systèmes à deux composants sont des circuits sensoriels que les bactéries utilisent pour réagir à leur environnement et survivre. Les bactéries utilisent les circuits, également connus sous le nom de voies de transduction du signal, pour détecter une "gamme inégalée de stimuli" allant des ions légers et métalliques au pH et même aux messages de leurs amis et voisins, a déclaré Jeffrey Tabor, professeur de bio-ingénierie à Rice.
Le nouvel outil optique de Tabor et du chercheur postdoctoral Ryan Butcher pour observer les réactions de phosphorylation en temps réel dans des systèmes à deux composants est décrit dans une étude publiée cette semaine dans les Proceedings of the National Academy of Sciences .
"Les bactéries utilisent des systèmes à deux composants pour activer la virulence et la résistance aux antibiotiques, coloniser les hôtes humains et végétaux, former des biofilms et encrasser les dispositifs médicaux", a déclaré Tabor, professeur de bioingénierie et de biosciences.
Le laboratoire de Tabor étudie les systèmes à deux composants depuis des années. En 2019, son équipe a dévoilé une boîte à outils de biohacking que les biologistes synthétiques pourraient utiliser pour mélanger et assortir des dizaines de milliers d'entrées sensorielles et de sorties génétiques des circuits.
L'une des utilisations les plus importantes de cette boîte à outils consistait à percer le double mystère des systèmes à deux composants. Comme leur nom l'indique, les circuits ont deux fonctions :détecter un stimulus à l'extérieur de la cellule et modifier le comportement de la cellule en réponse à ce stimulus.
Le premier composant, connu sous le nom de capteur kinase, dépasse généralement à travers la paroi externe de la cellule et ne peut être activé que par un signal chimique spécifique. Une fois déclenché, il déclenche une cascade biochimique, une réaction en chaîne à l'intérieur de la cellule qui se termine par un changement de comportement de la cellule en réponse aux stimuli.
La première étape de la cascade est un processus appelé phosphorylation, qui aboutit finalement à l'activation du deuxième composant du système, le régulateur de réponse.
Bien que les réactions de phosphorylation soient essentielles dans les dizaines de milliers de systèmes à deux composants utilisés dans les bactéries, il a été très difficile de les observer directement dans les bactéries vivantes. Cela s'explique en partie par le fait que les régulateurs de réponse doivent généralement se joindre pour former des paires afin de poursuivre la cascade biologique qui conduit à la réponse au stimulus.
"L'analyse expérimentale de la phosphorylation nécessite souvent une purification des protéines à partir de bactéries et une analyse à l'aide de méthodes in vitro laborieuses telles que l'électrophorèse sur gel", a déclaré Butcher.
Butcher a créé une méthode beaucoup plus simple qui utilise des étiquettes protéiques fluorescentes et une lumière fluorescente polarisée. Il a conçu des souches d'E. coli pour produire des sondes protéiques fluorescentes mNeonGreen qui dépolarisent la lumière d'un laser d'excitation, mais seulement si elles interagissent par paires. Dans une variété de tests, Butcher et Tabor ont montré que leur méthode pouvait être utilisée pour surveiller l'ampleur et la vitesse d'activation du régulateur de réponse dans diverses conditions environnementales.
La méthode est appelée "transfert d'énergie par résonance de fluorescence homotypique", ou homo-FRET en abrégé. Tabor a déclaré que les chercheurs peuvent l'utiliser pour suivre l'activation de systèmes à deux composants avec une résolution temporelle beaucoup plus élevée qu'auparavant.
Dans l'étude, lui et Butcher ont démontré l'utilité de l'homo-FRET en observant un système à deux composants activé par les nitrates qui est connu pour jouer un rôle dans la colonisation gastro-intestinale par E. coli, Salmonella et d'autres agents pathogènes.
"Les microbiologistes savent depuis un certain temps que ce circuit génétique est utilisé par un certain nombre d'agents pathogènes, mais nous ne comprenons toujours pas entièrement comment cela fonctionne", a déclaré Tabor.
En utilisant leur méthode, Tabor et Butcher ont découvert une impulsion d'activité non signalée auparavant dans le circuit en réponse à l'ajout de nitrate. L'impulsion semble survenir en raison de l'activation rapide du système à deux composants suivie de la consommation de nitrate par les bactéries et de la désactivation correspondante.
"C'est une fenêtre sur le fonctionnement de ce circuit, et c'est le genre de chose qui aurait été beaucoup plus difficile à cerner avec les méthodes précédentes", a déclaré Tabor. "Avec l'homo-FRET, nous pouvons voir le circuit réagir aux changements de niveaux de nitrates au fur et à mesure."
"Nous pensons que l'homo-FRET peut être utilisé pour concevoir des biocapteurs qui réagissent 10 fois plus rapidement que les alternatives actuelles, et que nous et d'autres pourrons l'utiliser pour faire de nouvelles découvertes dans une gamme d'autres voies bactériennes", a-t-il déclaré. Des biologistes synthétiques piratent des capteurs bactériens
