Les cellules observées sur une lame placée sous un microscope sont comptées à l'aide d'un outil de laboratoire commun connu sous le nom d'hémacytomètre ou chambre de numération cellulaire en association avec un colorant d'exclusion appelé bleu Trypan. Le colorant colore les cellules mortes en bleu mais ne peut pas entrer dans les cellules vivantes, qui apparaîtront comme des sphères blanches et brillantes à travers l'oculaire du microscope. Les scientifiques doivent compter les cellules afin de placer le nombre correct de cellules dans un milieu de culture cellulaire ou un réactif expérimental pour la quantification et l'analyse ou simplement pour empêcher les cellules de grossir.
Déterminer le type d'hémacytomètre (par exemple Neubauer) utilisé. Il s'agit essentiellement de lames de microscope épaisses contenant une zone centrale gravée avec des grilles de comptage. Placez-le sous un microscope réglé à un faible grossissement (10-20X) et ajustez la mise au point des lentilles jusqu'à ce que les grilles de comptage invidivuelles soient visibles.
Préparez une suspension cellulaire. Utilisez l'enzyme trypsine pour diviser le tissu en cellules individuelles, puis neutraliser la trypsine avec du sérum. Laver et culot les cellules, et remettre en suspension dans les médias ou une solution saline. Éliminez les agrégats cellulaires en pipetant doucement de haut en bas. Si la suspension semble trouble, diluez-la davantage avec plus de solution saline.
Utilisez du bleu Trypan pour exclure les cellules mortes. Transférer 10-20 microlitres de suspension cellulaire dans un tube stérile et mélanger avec exactement le même volume de colorant bleu Trypan en pipetant doucement. Cela dilue la suspension de cellules 1: 2 dans le bleu de Trypan. Préparez l'hémactyomètre. Essuyer avec de l'éthanol à 70%, sécher à l'air puis placer une lamelle sur les grilles de comptage. Dans le "drain" en haut de chaque grille, placez 10 microlitres de suspension cellulaire et laissez le "drain" le tirer sous la lamelle. Répétez l'opération pour cette autre grille de comptage jusqu'à ce que les deux aient une couche de suspension de cellules égale.
Comptez le nombre de cellules en utilisant le compteur manuel. Les cellules vivantes réfléchissent la lumière et apparaissent brillantes, blanchâtres et sphériques. Les cellules bleues sont mortes ou endommagées et ne doivent pas être comptées sauf si des numéros de cellules non viables sont requis. Répétez l'opération pour les 8 grilles de comptage, puis prenez la moyenne. Par exemple, si 800 cellules sont comptées dans 8 grilles, alors la moyenne par grille est de 100 cellules.
Calculer la densité cellulaire dans la suspension d'origine. Appliquer le nombre moyen de cellules à la formule suivante: Concentration cellulaire = nombre moyen de cellules X facteur de dilution X 10 000 (= 2, si dilution est 1: 2) X volume de suspension (en millilitres, ajuster au besoin pour microlitres et ainsi de suite ).
Nettoyez l'hémacytomètre. Laver la suspension cellulaire, essuyer l'hémacytomètre avec de l'eau de Javel et /ou de l'isopropanol à 70%, ou inonder avec de l'éthanol à 70%. Laisser sécher ou essuyer avec un chiffon non pelucheux et jeter toutes les suspensions cellulaires indésirables dans des récipients à risques biologiques.
Avertissement
Le bleu Trypan est un mutagène et des taches permanentes, alors assurez-vous que les vêtements protecteurs et des gants sont portés avant de continuer.
