Par Pete Collins | Mis à jour le 30 août 2022
L'électrophorèse sépare les macromolécules telles que les protéines et les acides nucléiques par taille, charge et autres propriétés physicochimiques. Dans les séparations basées sur la charge, une solution tampon transmet le champ électrique et maintient un pH stable, préservant ainsi la charge et la structure natives des analytes. Cette stabilité est essentielle pour une résolution précise.
L'électrophorèse exploite un champ électrique appliqué (ou un gradient chimique dans des techniques spécialisées) pour déplacer des molécules chargées à travers une matrice de gel. Les molécules migrent vers l'électrode de charge opposée :les espèces chargées négativement se déplacent vers l'anode, les espèces chargées positivement vers la cathode. Étant donné que les molécules plus grosses subissent davantage de frictions au sein du gel, elles se déplacent plus lentement que les plus petites, ce qui permet une séparation basée sur la taille. La distance migrée peut être tracée sur une échelle logarithmique pour estimer le poids moléculaire ou la longueur des fragments.
La DGGE introduit un gradient dénaturant, généralement un mélange d'urée et de formamide, dans le gel. À mesure que les fragments d’ADN traversent le gradient, des concentrations croissantes de dénaturants déstabilisent progressivement la double hélice. Chaque fragment cesse de migrer une fois que la concentration locale de dénaturant atteint son point de fusion. Cette technique exploite le comportement de fusion dépendant de la séquence pour résoudre des fragments d'ADN de longueur identique mais de séquence différente.
Dans l’électrophorèse basée sur la charge, les espèces ioniques du tampon conduisent le champ électrique appliqué à travers le gel, assurant ainsi une distribution uniforme du courant. Simultanément, la faible paire acide-base du tampon maintient le pH dans une fenêtre étroite. Étant donné que l'état de charge et la structure tridimensionnelle des protéines et des acides nucléiques dépendent du pH, un pH stable évite les changements conformationnels involontaires qui pourraient compromettre la fidélité de la séparation.
Le choix du bon tampon dépend de la plage de pH souhaitée et de la nécessité de minimiser la force ionique, qui pourrait autrement générer une chaleur et une distorsion excessives. Les tampons couramment utilisés incluent :
Pour des performances optimales, le pKa du tampon doit être proche du pH cible et la force ionique globale doit être suffisamment faible pour limiter l'échauffement induit par le courant tout en permettant un transfert de charge efficace.
En sélectionnant et en maintenant soigneusement les conditions du tampon, les chercheurs peuvent obtenir des séparations reproductibles et à haute résolution essentielles aux analyses en aval.
