Des chercheurs de l'Institut Max Planck pour la science de la lumière à Erlangen ont développé une technique pour observer directement comment les enzymes et autres biomolécules accomplissent leur travail, avec des avantages médicaux et scientifiques potentiellement importants. En utilisant cette technique, ils ont, pour la première fois avec juste de la lumière et sans marqueur, des changements de conformation observés dans l'ADN polymérase, l'enzyme responsable de la réplication de l'ADN. Parce que la technique peut également être utilisée pour étudier comment les enzymes accomplissent leur travail, cela pourrait aider à identifier de nouveaux mécanismes pour le développement de médicaments.

Quand les biologistes regardent à travers un microscope moderne, ce qu'ils voient est un peu ce que vous pourriez voir si vous regardiez le long d'une autoroute la nuit :les véhicules ne sont visibles que par leurs phares et il est impossible de dire si les phares appartiennent à une voiture ou à un camion, ou si une voiture garée ouvre sa porte. Maintenant, les biologistes ne peuvent observer les enzymes qu'indirectement. Ils attachent des colorants fluorescents aux composants individuels des biomolécules, puis observent les points lumineux se déplacer au microscope. Ils peuvent très peu voir comment la forme de l'enzyme change. En outre, avoir une molécule de colorant attachée signifie que l'enzyme qu'ils surveillent n'est pas dans son état naturel. Il n'est pas exclu que de telles molécules de colorant puissent affecter la fonction de l'enzyme.

Une équipe de chercheurs dirigée par Frank Vollmer, jusqu'à récemment, chef d'un groupe de recherche à l'Institut Max Planck pour la science de la lumière et maintenant professeur à l'Université d'Exeter, a, cependant, développé une technique pour leur permettre d'observer les enzymes sans attacher un marqueur fluorescent.

Une nanotige concentre la lumière sur une zone de quelques nanomètres seulement

Leur instrument microscopiquement petit est en fait un capteur sur un capteur. Une nanotige d'or d'environ 10 nanomètres de diamètre et 40 nanomètres de long est attachée à une microbille de verre d'un diamètre d'environ 80 micromètres (1 micromètre =1/1000 millimètre). Une onde lumineuse, produit par un laser, est envoyé frémir autour du bord intérieur de cette microbille. Parce que cette onde chevauche très légèrement le bord de la microbille, il interagit avec la nanotige attachée.

Cette interaction commence assez faiblement, mais la microbille agit comme une galerie chuchotante :Dans une rotonde, un mot chuchoté le long du mur peut être clairement entendu de l'autre côté, parce que l'onde sonore suit la courbe du mur plutôt que d'être dispersée dans toutes les directions. De la même manière, l'onde lumineuse qui fait le tour de l'intérieur de la microbille passe des milliers de fois la nanotige en or dans un laps de temps extrêmement court, amplifier l'interaction avec la nanotige.

La nanotige attire davantage la lumière recouvrant le bord de la microbille. Le résultat est une zone de lumière concentrée comme un projecteur approximativement de la même taille que la tige, c'est-à-dire quelques nanomètres de diamètre. Si une enzyme ou une autre molécule se lie ensuite à la nanotige en or, il est baigné de ce projecteur. Le signal produit par le capteur dépend de la molécule placée sous le projecteur et de la façon dont elle se déplace dans cette lumière. Cela permet aux chercheurs d'étudier et d'enregistrer les mouvements d'une seule molécule d'enzyme.

Différents signaux pour différentes conformations enzymatiques

La technique est basée sur un phénomène connu sous le nom de plasmonique. Appliqué à de minuscules structures métalliques telles que les nanotiges, la plasmonique permet de concentrer la lumière sur une zone de quelques nanomètres seulement. "Cela nous permet de réduire la lumière à la taille d'une enzyme, " explique Frank Vollmer de l'Institut Max Planck pour la science de la lumière à Erlangen. Et même plus loin - les chercheurs d'Erlangen ont même réussi à utiliser leur technique pour sonder des ions individuels.

Dans une expérience, les physiciens ont attaché l'enzyme ADN polymérase à leur capteur et ont ensuite essayé d'enregistrer son mouvement. L'ADN polymérase ressemble à une main tenant un tuyau - le tuyau dans ce cas étant le brin d'ADN qu'il traite. Cette "main" produit un signal différent lorsqu'elle est ouverte et lorsqu'elle est fermée, car cela modifie la taille du chevauchement entre la tache lumineuse et l'enzyme. Cela a permis aux chercheurs d'enregistrer comment l'enzyme s'ouvre et se ferme en temps réel. "Un affinement supplémentaire de notre technique devrait nous permettre de faire des choses comme enregistrer directement la synthèse d'un brin d'ADN par l'enzyme polymérase, " explique Vollmer. Les biochimistes pourraient alors observer en temps réel comment l'enzyme copie l'information génétique et même utiliser le signal produit par le nanocapteur pour le séquençage de l'ADN.

Les expériences utilisant la nouvelle technique ont permis d'observer bien plus que la façon dont les enzymes se déplacent. "Nous l'avons utilisé pour observer la dépendance à la température de l'activité enzymatique, " explique Frank Vollmer. Cela offre un moyen simple d'effectuer des études thermodynamiques. De telles études peuvent fournir des informations sur des caractéristiques telles que l'énergie d'activation d'une enzyme, explique le physicien. L'énergie d'activation est une mesure de l'efficacité de ces catalyseurs biologiques.

Le nanocapteur peut être utilisé pour observer des réactions chimiques

Pour démontrer à quel point les particules pouvant être détectées à l'aide d'un nanocapteur plasmonique peuvent être petites, les chercheurs l'ont utilisé pour observer des ions individuels (atomes chargés électriquement). "Nous avons été surpris que cela soit même possible, " dit Vollmer. Les ions zinc et mercure qu'ils ont utilisés ne mesurent qu'un dixième de nanomètre environ, soit moins d'un millième de la longueur d'onde de la lumière utilisée. cependant, possible de produire une tache lumineuse à l'extrémité d'une nanotige qui est capable de sonder de si petites dimensions. "Il ne s'agit pas d'identifier des ions individuels, " souligne Vollmer. Les chercheurs ont pu s'assurer qu'exactement un ion s'est attaché à l'extrémité de la nanotige en faisant varier la concentration d'ions en solution. Descendre à cette échelle pourrait permettre aux biologistes d'étudier la fonction des canaux ioniques. Les canaux ioniques comprennent, par exemple, protéines intégrées dans les membranes des cellules nerveuses qui sont responsables de la transmission du signal le long du nerf.

L'utilisation du nanocapteur développé par l'équipe de Frank Vollmer ne se limite pas à la visualisation de processus biochimiques impliquant des enzymes et d'autres protéines. Il peut également être utilisé pour observer des réactions chimiques entre des molécules individuelles et la surface de la nanotige d'or. « En utilisant cette technique, nous pouvons, par exemple, détecter et analyser les mécanismes d'interaction, " explique Frank Vollmer. L'évolution dans le temps de ces interactions peut fournir des informations sur la façon dont différentes molécules se lient à la surface de la nanotige d'or.

Pour le démontrer, les chercheurs ont étudié deux types de molécules, un contenant un groupe amine, un contenant un groupe thiol. "Il s'avère que les deux groupes réagissent avec la surface de l'or via des mécanismes différents, " explique Vollmer. Alors que les groupes amine se lient aux atomes d'or qui dépassent de la surface, les groupes thiol ne se lient qu'aux atomes complètement enfoncés dans la surface.

Les chercheurs ont également observé des réactions entre les différentes molécules. « Cela permet aux chimistes de tester et d'optimiser les conditions de réaction en temps réel, " dit Vollmer. L'utilisation de ce spot lumineux en nanotige d'or ne se limite pas à l'étude des réactions chimiques, cependant - il peut également être utilisé pour les contrôler. En augmentant l'intensité de la lumière dans le spot lumineux concentré, les chercheurs ont permis à un ion mercure de se lier à la surface de la nanotige en or. L'intensité de la lumière dans la tache lumineuse augmente l'énergie des électrons dans la tige d'or afin qu'ils soient capables de réagir avec les ions mercure. Cela produit un amalgame stable d'or et de mercure. Les deux éléments restent amalgamés même lorsque la tache lumineuse disparaît, car la réaction produit une liaison covalente relativement stable entre un atome d'or et un atome de mercure.

"Le contrôle des réactions et de l'activité enzymatique sur le biocapteur plasmonique est un domaine très intéressant pour de futures recherches, " dit Vollmer. Le spot lumineux peut également être utilisé comme une pince à épiler optique pour fixer temporairement des biomolécules individuelles au capteur pour une analyse optique.

Aperçu des dysfonctionnements de la machinerie de la vie

La vision future de l'équipe de Vollmer est de pouvoir scanner des molécules – à la fois des biomolécules et des molécules synthétiques – atome par atome. "En utilisant différentes sources lumineuses avec différentes longueurs d'onde et polarisations, il est en principe possible de modifier le degré de recouvrement de la lumière sur la molécule et de sonder différents domaines d'une même molécule, " explique Vollmer. Un scanner moléculaire de ce type pourrait être capable d'observer un processus sous différents angles et à des intervalles très courts. Une carte à haute résolution d'un tel processus améliorerait considérablement notre compréhension de la machinerie moléculaire. Les biologistes pourraient même être capable d'observer en détail comment de telles structures évoluent sur des périodes allant de la nanoseconde à plusieurs heures.Le biocapteur plasmonique soulève également la possibilité d'un laboratoire automatisé pas plus gros qu'un ongle, qui scanne un échantillon, protéine par protéine, pour diagnostiquer la maladie au niveau moléculaire.

S'il devenait possible à l'avenir d'utiliser des nanocapteurs plasmoniques pour voir comment les enzymes changent de forme, cela pourrait permettre aux cliniciens de mieux comprendre comment les dysfonctionnements de la machinerie de la vie provoquent des maladies telles que la maladie d'Alzheimer, qui sont associés à des changements dans la structure enzymatique. Une meilleure compréhension de ces processus pourrait même fournir de nouvelles approches de traitement.