Par Marcia Spear
Mis à jour le 24 mars 2022
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La coloration de Gram est une technique microbiologique fondamentale qui distingue les bactéries Gram-positives des bactéries Gram-négatives en fonction de la structure de leur paroi cellulaire et de la couleur qui en résulte. L'alcool acétonique joue un rôle central en tant qu'agent décolorant, permettant à la différenciation finale de la couleur de révéler l'identité bactérienne.
Après avoir préparé un frottis bactérien, du crystal violet est appliqué pendant 30 secondes. À ce stade, les cellules Gram-positives et Gram-négatives apparaissent uniformément violettes. Un bref lavage à l'eau élimine l'excès de colorant, bien qu'une partie du cristal violet reste liée aux épaisses couches de peptidoglycane des cellules à Gram positif.
L'iode est ajouté pendant une minute, agissant comme un mordant qui se lie au cristal violet et forme un complexe cristal violet-iode insoluble. Ce complexe adhère fortement au peptidoglycane robuste des bactéries à Gram positif, sécurisant ainsi la coloration primaire sans rinçage ultérieur à l'eau.
L'acétone ou l'alcool éthylique sont utilisés pendant 10 à 20 secondes pour éliminer le complexe cristal violet-iode des cellules à Gram négatif. L'alcool dissout la membrane lipidique externe, permettant au colorant de s'échapper de la couche plus fine de peptidoglycane. Une fois le ruissellement incolore, un rinçage à l’eau stoppe l’action décolorante. Les cellules Gram-positives conservent la coloration violette, tandis que les cellules Gram-négatives deviennent incolores.
La safranine est appliquée pendant environ une minute pour créer un contraste, colorant en rose les bactéries à Gram négatif désormais incolores. Le masque violet cristal plus foncé garantit que les cellules Gram-positives restent violettes. Un dernier rinçage à l'eau élimine l'excès de safranine.
