1. Incapacité de s'appliquer aux organismes asexués: Le concept d'espèces biologiques définit une espèce comme un groupe d'organismes qui peuvent se croiser et produire des descendants fertiles. Les organismes asexués, comme les bactéries et certaines plantes, se reproduisent sans accouplement, donc ce concept ne s'applique pas à eux. La détermination des limites des espèces dans ces organismes nécessite d'autres méthodes comme l'analyse génétique.

2. Difficultés d'application à l'hybridation des espèces: Certaines espèces peuvent se croiser et produire une progéniture fertile, même si elles sont considérées comme des espèces distinctes. Ceci est courant dans les plantes et se produit également chez certains animaux. Par exemple, le loup gris et le coyote peuvent se croiser, ce qui rend difficile d'appliquer le concept d'espèce biologique dans ces cas. Cette ambiguïté peut conduire à un désaccord sur l'endroit où se termine une espèce et une autre commence.