L'isolement d'une protéine membranaire nécessite un processus en plusieurs étapes, en tenant compte des caractéristiques spécifiques de la protéine et du résultat souhaité. Voici un aperçu général du processus:
1. Lyse cellulaire:
* perturber la membrane cellulaire: Ceci est crucial pour libérer les protéines membranaires de la cellule. Il existe différentes méthodes, notamment:
* sonication: En utilisant des ondes sonores pour briser la membrane cellulaire.
* French Press: Appliquer une haute pression pour forcer les cellules par une ouverture étroite.
* détergents: Utilisation de détergents comme Triton X-100 ou Chaps pour solubiliser la membrane cellulaire.
* enzymes: L'utilisation d'enzymes comme le lysozyme pour briser la paroi cellulaire dans les cellules bactériennes.
* Choisir la bonne méthode: La méthode dépend du type de cellule, des propriétés des protéines membranaires et de l'objectif expérimental. Par exemple, des méthodes douces comme la sonication sont préférées pour les protéines délicates.
2. Fractionnement cellulaire:
* Séparation des composants cellulaires: Après la lyse, le lysat cellulaire contient divers composants comme les organites, le cytoplasme et les fragments membranaires. Le fractionnement cellulaire sépare ces composants en fonction de leur taille, de leur densité et d'autres propriétés.
* techniques utilisées:
* Centrifugation différentielle: Cette méthode tourne le lysat à des vitesses croissantes pour séparer les composants en fonction des taux de sédimentation.
* Centrifugation du gradient de densité: Cette méthode utilise un gradient de densité (par exemple, le saccharose) pour séparer les composants en fonction de leur flottabilité.
* Chromatographie d'affinité: Cette méthode utilise des interactions spécifiques entre la protéine membranaire et un ligand attaché à une matrice solide pour isoler sélectivement la protéine.
3. Solubilisation des protéines membranaires:
* Intégrité de la membrane perturbatrice: Les protéines membranaires sont hydrophobes et doivent être solubilisées pour être davantage purifiées. Les détergents sont couramment utilisés pour perturber la structure de la membrane et permettent à l'extraction des protéines.
* Choisir le bon détergent: Les détergents sont choisis en fonction de leurs propriétés, tels que leur concentration critique de micelles (CMC), leur capacité à solubiliser différentes protéines membranaires et leur compatibilité avec les applications en aval.
* Autres méthodes: Dans certains cas, d'autres agents solubilisants comme les lipides, les phospholipides ou les détergents non ioniques peuvent être utilisés pour maintenir la structure native de la protéine.
4. Purification des protéines:
* séparant la protéine cible: Plusieurs méthodes sont utilisées pour la purification, notamment:
* Chromatographie d'affinité: Cette méthode utilise une interaction spécifique entre la protéine cible et un ligand attaché à une matrice solide.
* Chromatographie d'exclusion de taille: Cette méthode sépare les protéines en fonction de leur taille.
* chromatographie d'échange d'ions: Cette méthode sépare les protéines en fonction de leur charge.
* Optimisation de la purification: Chaque méthode nécessite des conditions spécifiques, telles que la composition du tampon, le pH et la température, pour obtenir une séparation optimale.
5. Caractérisation des protéines:
* confirmant l'identité de la protéine: Une fois isolé, la protéine doit être caractérisée pour assurer son identité et sa pureté.
* techniques utilisées:
* SDS-PAGE: Cette technique sépare les protéines en fonction de leur taille, fournissant des informations sur le poids moléculaire de la protéine.
* Western blot: Cette technique utilise des anticorps pour détecter spécifiquement la protéine cible, confirmant son identité.
* Mass spectrometry: Cette technique identifie et quantifie la protéine en analysant son rapport masse / charge.
Considérations importantes:
* Stabilité des protéines: Les protéines membranaires sont souvent délicates et sujettes à la dégradation. Le maintien de conditions optimales, y compris la basse température et le tampon approprié, est crucial pendant l'ensemble du processus d'isolement.
* Préserver l'activité des protéines: La méthode d'isolement devrait viser à préserver l'activité biologique de la protéine, en particulier pour les études fonctionnelles.
* Exigences spécifiques: Le protocole spécifique pour isoler une protéine membranaire varie en fonction des caractéristiques de la protéine, du résultat souhaité et des ressources disponibles.
En conclusion, l'isolement d'une protéine membranaire est un processus complexe qui nécessite une planification et une exécution méticuleuses. Les étapes et techniques spécifiques utilisées varient en fonction de la protéine spécifique et des besoins expérimentaux. En considérant soigneusement chaque étape, les chercheurs peuvent isoler et caractériser avec succès les protéines membranaires pour une étude plus approfondie.
