1. Perturbation des cellules:
* Méthodes mécaniques:
* homogénéisation: Utilisation d'un mélangeur ou d'un homogénéisateur à grande vitesse pour briser physiquement les cellules ouvertes.
* sonication: En utilisant des ondes sonores pour perturber les membranes cellulaires.
* French Press: Forcer les cellules à travers une petite ouverture sous haute pression.
* broyage: En utilisant un mortier et un pilon pour casser physiquement les cellules.
* Méthodes chimiques:
* détergents: Perturber les membranes cellulaires en dissolvant les lipides.
* enzymes: Utilisez des enzymes spécifiques comme le lysozyme pour dégrader les parois cellulaires.
* choc osmotique: Changer la pression osmotique de la solution pour perturber les membranes cellulaires.
2. Centrifugation différentielle:
* Après perturbation cellulaire, le lysat cellulaire est tourné à des vitesses et des durées croissantes. Cela sépare les composants en fonction de leur taille et de leur densité.
* Centrifugation à basse vitesse: Composants plus grands à granulés comme les noyaux et les débris cellulaires.
* Centrifugation à moyenne vitesse: Mitochondries et lysosomes de granulés.
* Centrifugation à grande vitesse: Microsomes et ribosomes à granulés.
* ultracentrifugation: Composants plus petits de pastilles comme les protéines et les acides nucléiques.
3. Centrifugation du gradient de densité:
* Cette méthode affine en outre la séparation obtenue par centrifugation différentielle. Un gradient de saccharose ou d'autres substances est créé dans un tube, et le lysat cellulaire est superposé sur le dessus. Pendant la centrifugation, les composants se déplacent à travers le gradient jusqu'à ce qu'ils atteignent une densité égale à la leur.
* Types:
* Gradient de saccharose: Couramment utilisé pour séparer les organites.
* gradient de chlorure de césium: Excellent pour l'isolement de l'ADN et de l'ARN.
4. Chromatographie d'affinité:
* Cette méthode exploite la liaison spécifique d'une molécule cible à un ligand immobilisé sur une colonne.
* ligand: Une molécule qui se lie spécifiquement à la molécule cible.
* colonne: Une matrice solide avec le ligand immobilisé.
* Élution: Après liaison, la molécule cible est éluée à partir de la colonne à l'aide d'une solution spécifique.
5. Électrophorèse:
* Utilisé pour séparer les protéines en fonction de la taille et de la charge, et des acides nucléiques en fonction de la taille.
* SDS-PAGE: Sépare les protéines en fonction de la taille.
* électrophorèse sur gel d'agarose: Sépare les acides nucléiques en fonction de la taille.
6. Immunoprécipitation:
* Cette méthode utilise des anticorps pour isoler des protéines spécifiques.
* anticorps: Se lier à une protéine d'intérêt spécifique.
* Précipitation: Après liaison, le complexe protéine-anticorps est précipité hors de la solution.
7. Cytométrie en flux:
* Cette méthode utilise des lasers et des sondes fluorescentes pour analyser et trier les cellules ou les composants cellulaires en fonction de leurs caractéristiques physiques et biologiques.
Exemple:isoler les mitochondries
* Les cellules sont perturbées en utilisant l'homogénéisation ou une presse française.
* Le lysat cellulaire est centrifugé à une vitesse moyenne pour les mitochondries de granulés.
* Le culot est remis en suspension et purifié davantage en utilisant la centrifugation du gradient de densité.
Le choix de la méthode dépend du type de cellule spécifique, de l'organelle ou de la molécule d'intérêt et du niveau de pureté souhaité. Chaque technique a ses forces et ses faiblesses, et les chercheurs utilisent souvent une combinaison de méthodes pour obtenir les résultats souhaités.
