Les membranes cellulaires sont constituées de phospholipides et de protéines fixées ou incorporées. Les protéines membranaires jouent un rôle vital dans le métabolisme et la vie de la cellule. Vous ne pouvez pas utiliser la microscopie ordinaire pour visualiser ou caractériser des protéines d'adhésion, transporter des protéines et des canaux protéiques dans la membrane cellulaire. L'utilisation de la microscopie électronique et d'une technique appelée «fracture par congélation», qui divise les membranes cellulaires gelées, permet de visualiser la structure de la membrane et l'organisation des protéines dans la mer de phospholipides. La combinaison d'autres méthodes avec la fracturation par congélation nous aide non seulement à comprendre la structure des différentes membranes cellulaires et protéines membranaires, mais permet la visualisation et l'analyse détaillée de la fonction de protéines, bactéries et virus spécifiques.
Étapes de base de la fracture par congélation
À l'aide d'azote liquide, les échantillons de tissus biologiques ou les cellules sont rapidement congelés pour immobiliser les constituants cellulaires. Les membranes cellulaires sont composées de deux couches de phospholipides, appelées bicouche, où les queues lipidiques hydrophobes ou détestables par l'eau pointent vers l'intérieur de la membrane et les extrémités hydrophiles ou hydrophiles de la molécule lipidique pointent vers l'extérieur et vers l'intérieur de la cellule. L'échantillon congelé est fissuré ou fracturé avec un microtome, qui est un instrument en forme de couteau pour couper de fines tranches de tissu. Cela fait que la membrane cellulaire se sépare précisément entre les deux couches car l'attraction entre les queues lipidiques hydrophobes représente le point le plus faible. Après la fracturation, l'échantillon subit une procédure sous vide, appelée «gravure par congélation». La surface de l'échantillon fracturé est masquée de vapeur de carbone et de platine pour en faire une réplique stable, qui suit les contours du plan de fracture. L'acide est utilisé pour digérer les matières organiques adhérant à la réplique, laissant une mince coquille de platine de la surface de la membrane fracturée. Cette coquille est ensuite analysée par microscopie électronique.
Gravure par congélation
La gravure par congélation est le séchage sous vide d'un échantillon biologique non fixé, congelé et fracturé par congélation. La procédure de séchage sous vide est similaire à la lyophilisation des fruits et légumes qui sont emballés et vendus dans les épiceries. Sans gravure gel, de nombreux détails de la structure cellulaire sont masqués par les cristaux de glace. L'étape de gravure profonde ou par congélation améliore et étend la méthode originale de fracture par congélation, permettant l'observation des membranes cellulaires au cours de diverses activités. Il permet d'analyser non seulement la structure de la membrane, mais aussi des composants intracellulaires et fournit des informations structurelles détaillées sur les bactéries, les virus et les grands complexes de protéines cellulaires.
Microscopie électronique
La microscopie électronique peut révéler et agrandir plus plus d'un million de fois les plus petits organismes ou structures, tels que les bactéries, les virus, les composants intracellulaires et même les protéines. La visualisation est créée en bombardant un échantillon ultra-mince avec un faisceau d'électrons. Les deux méthodes de microscopie électronique sont la microscopie électronique à balayage, ou SEM, et la microscopie électronique à transmission, ou TEM. Les échantillons de fracture par congélation sont systématiquement analysés avec TEM. TEM a une meilleure résolution que SEM et offre des informations structurelles jusqu'à 3 nanomètres de répliques.
Révélation de la structure de la membrane cellulaire
Le développement et l'utilisation de la microscopie électronique à rupture par congélation ont montré que les membranes plasmiques cellulaires sont constituées de bicouches lipidiques et clarifié comment les protéines sont organisées au sein des membranes cellulaires. La fracture par congélation donne un aspect unique à l'intérieur des membranes cellulaires, car elle divise et sépare les phospholipides membranaires en deux feuilles ou faces opposées et complémentaires. Depuis plus de 50 ans depuis l'introduction de la première machine de fracturation par congélation, la fabrication d'une réplique de platine est toujours le seul moyen d'obtenir des informations structurelles sur la membrane cellulaire. La technique montre si des protéines spécifiques flottent ou sont ancrées dans la membrane cellulaire, et si et comment certaines protéines s'agrègent. Une nouvelle méthode - utilisant des anticorps qui ciblent des protéines spécifiques - est associée à une fracture par congélation pour identifier les protéines et leur fonction dans la membrane cellulaire.
